Summary

קביעת הפעילות של תנועה הספונטנית ב<em> Melanogaster דרוזופילה</em

Published: April 10, 2014
doi:

Summary

תסיסנית שימושית בלומדת מניפולציות גנטיות או סביבתיות המשפיעות על התנהגויות כמו פעילות של תנועה ספונטנית. כאן אנו מתארים פרוטוקול אשר מנצל צגים עם קרניים אינפרא אדומות ותוכנות לניתוח נתונים לכמת פעילות של תנועה ספונטנית.

Abstract

melanogaster דרוזופילה שמש כאורגניזם מודל מצוין ללמוד מניפולציות סביבתיות וגנטיות המשפיעות על התנהגות. התנהגות כזו היא פעילות של תנועה ספונטנית. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו אשר מנצל צגי אוכלוסיית דרוזופילה ומערכת מעקב המאפשרת ניטור רציף של הפעילות של תנועה הספונטנית של זבובים במשך כמה ימים בכל פעם. שיטה זו היא פשוטה, אמינה, ואובייקטיבית וניתן להשתמש בם כדי לבחון את השפעות הזדקנות, מין, שינויים בתוכן הקלורי של מזון, תוספת של תרופות, או מניפולציות גנטיות המחקות מחלות אנושיות.

Introduction

זבובי פירות, דרוזופילה melanogaster, שימשו כמודל אורגניזם רב ערך כדי ללמוד מנגנוני התנהגויות מורכבות, כגון למידה וזיכרון, אינטראקציה חברתית, תוקפנות, שימוש בסמים, שינה, תפקוד חושי, חיזור, הזדווגות ו1,2. התנהגות אחד שנחקרה באמצעות פרוטוקולים מרובים היא פעילות של תנועה ספונטנית. geotaxis השלילית הייתה אחת מהשיטות הראשונות שפותחו למדידת פעילות דרוזופילה, ופרוטוקול זה כולל מדידת אחוז של זבובים שמגיעים לגובה מסוים של הבקבוקון לאחר הזבובים הזדעזעו לחלק התחתון של 1,3 מיכל. לשיטה זו יתרונות של להיות פשוט, זול, ומאז היא אינה דורשת שום ציוד מיוחד אותו ניתן לבצע בכל מעבדה. זה כבר נעשה שימוש ככלי מיון רב ערך כדי ללמוד את ההשפעות של מניפולציות גנטיות שונות על לטוס ניידות 3. עם זאת, זה זמן ועבודה אינטנסיביתיש nd האפשרות של הטיה עקב טלטול משתנה של הבקבוקונים והקלטות אנושיות.

שיטת geotaxis השלילית שופרה על ידי פיתוח השיטה המהיר איטרטיבי שלילי geotaxis (טבעת) 4,5, אשר לוקחת תמונות של הבקבוקונים לטוס הבאים רועד של הזבובים לתחתית. היתרון של פרוטוקול זה הוא הרגישות שלו ואת האפשרות של בדיקת מספר רב של בקבוקונים לטוס באותו הזמן. עם זאת, פרוטוקול זה עדיין יש לו את הפוטנציאל לטעויות אנושות, ורק מודד geotaxis השלילית. מעבדות אחרות השתמשו בתצפית פשוטה בבקבוקוני תרבות כדי לקבוע פעילות של תנועה 6.

לאחרונה מספר מערכות הקלטת וידאו למדידת פעילות של תנועה זבוב פותחו. פרוטוקול ניטור וידאו אחד מספק זמן להסתגלות לפני הקלטת 7. השיטה שתוארה על ידי Slawson et al. משתמשת גם דופק אוויר להפסיק movemenלא עד לתחילת הקלטה, אשר עלול להיות גורם לחץ לבעלי החיים 7. שיטה זו מספקת מידע על מהירות ממוצעת, מהירות מקסימלית, לבזבז זמן בתנועה, וכו 'מערכת מעקב תלת ממדים אחר מודדת את המהירות המקסימלי של זבובים בודדים במהלך ~ 0.2 שניות של ההמראה טיסה חינם 8. פרוטוקול ניטור וידאו תלת ממדים משתמש זבובים להביע GFP ומספר רבים של מצלמות מצויד במסננים המאפשרים זיהוי של הקרינה כדי לקבוע לטוס ניידות 9. זבובים בפרוטוקול זה נוטים להפגין דפוסי טיסה גליליים, שהוא עלול להיות בגלל הצורה של תרבות דרוזופילה בקבוקונים 10. שיטה זו שופרה באמצעות כיפה המאפשרת מדידת תנועה ספונטנית של שני זבובים 11. שיטת תפוקה גבוהה המשתמשת במצלמה כדי לעקוב באופן אוטומטי ולכמת את ההתנהגות האישית וחברתית של דרוזופילה הייתה גם תיארתי 12. Zou etאל. פיתח מערכת התנהגותיות צג (BMS), שמשתמשת בשתי מצלמות בסיוע מחשב להקליט כל החיים התנהגות ותנועות כגון מנוחה, נעו, מעופפים, אכילה, שתייה, או מותם של פירות tephritid בודדים עף 13. מספר מערכות וידאו אחרות פותחו כדי לעקוב אחר פעילות התנהגותית זבוב 14,15.

כאן אנו מתארים שיטה לכימות פעילות דרוזופילה שמנצלת צגי אוכלוסייה. צגים אלה הם שוכנו ובטמפרטורת חממות מבוקרת לחות ב ° C25 על מחזור אור היום והלילה 12 שעה. לכל אחד יש לפקח אוכלוסיית קרניים אינפרא אדומות הוצבו בטבעות ממוקמות בשלושה גבהים שונים. בכל פעם שזבוב עובר על פני הטבעות זה קוטע את הקרן אינפרא אדומה, אשר נרשמה על ידי מעבד שבאופן עצמאי רשומות וסופרת את הפעילות של זבובים בתוך הבקבוקון. מעבד טוען את הפעילות הכוללת בתוך הבקבוקון למחשב בinterva הגדרת המשתמשls שיכול להשתנות משנייה 1 עד 60 דקות. השיטה המתוארת כאן מספקת מספיק זמן לזבובים להסתגל לסביבה החדשה ומאפשרת מדידה בו זמנית של הפעילות של תנועה הספונטנית של כמה ש120 אוכלוסיות של זבובים. בנוסף, אנו מתארים הכנת האוכל, לעוף תחזוקה, הקמת צגי ניידות אוכלוסייה בחממות בטמפרטורה מבוקרת, וגורמים פוטנציאליים שעשויים להשפיע על תוצאות. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור כיצד שינויים גנטיים או סביבתיים שונים משפיעים על הפעילות של תנועה ספונטנית של הזבובים.

Protocol

הערה: זן קנטון-S הוא קו הרקע הסטנדרטי פראי מהסוג שהתקבל ממרכז מלאי בלומינגטון. 1. הכנת מזון ומתכון ל1,000 מיליליטר של מזון הערה: סעיף זה מתאר את הפרוטוקול להכנת מזון. סירי מתכת גדולים משמשים להכנה כ…

Representative Results

הפעילות של תנועה הספונטנית בדרוזופילה תלויה במין זבוב (איור 3 א), כמות קלוריות של המזון (איור 3 ב) ומחזור האור / חושך. ברגע שהאור כבוי פעילות זבוב מקטינה באופן דרמטי. איור 3A ממחיש 24 שעות הקלטת הפעילות של תנועה של זבובי זכרים ונקבות. כוכ?…

Discussion

פעילות של תנועה ספונטנית של זבובים מושפעים מגורמים רבים כגון גיל, רקע גנטי, ומין 2,13,18,19. בנוסף, גורמים סביבתיים כגון תוכן הקלורי של מזון, בטמפרטורה של הסביבה, תוספת של תרופות שונות, ומחזור אור היום / הלילה יכולים להשפיע על פעילות זבוב. למשל, יש לי זבובי זכרים באותו …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות (AG023088 לBR).

Materials

Sucrose FCC Food Grade 100 LB, Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90471380
Brewer’s Yeast Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90331280
Drosophila Agar Fine SciMart DR-820-25F
Cornmeal Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90141125
Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept Sigma H5501-5KG
EtOH Pharmco-AAPER 111000200
Active Dry Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Fly CO2 pad LabScientific BGSU-7
Stereo Microscope Olympus SZ40
Drosophila carbon dioxide (CO2) tank Airgas UN1013
Small paint brush for pushing the flies
Shell vial wide Fischer Scientific AS519
Buzzplugs for wide plastic vials Fischer Scientific AS275
Glass vials (25x95mm) Fischer Scientific Kimble 60931-8 AS-574
Sponge plugs for glass vials SciMart DR-750
Drosophila Food Dispenser Applied Scientific (Fischer Scientific) AS780Q
DPM Drosophila Population Monitor Trikinetics Inc.
DC Power Supply with line cord Trikinetics Inc.
PSIU9 The Power Supply Interface Unit Trikinetics Inc.
Telephone cables and 5 way splitters Trikinetics Inc.
Universal Serial Bus (USB) hardware Trikinetics Inc.
Macintosh or Windows PC with UCB port
DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel) www.trikinetics.com
DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7) www.trikinetics.com
DAMFileScan108X software for Macintosh www.trikinetics.com
DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7) www.trikinetics.com
USB software (PSIUdrivers.zip) www.trikinetics.com
DAMSystem Notes 308 (http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf

Referenzen

  1. Ali, Y. O., Escala, W. E., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. 49, 2504 (2011).
  2. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and behaviors. Exp. Gerontol. 46 (5), 320-325 (2011).
  3. Grotewiel, M. S., Martin, I., Bhandari, p., Cook-Wiends, E. Functional senescence in Drosophila melanogaster. Aging Res. Rev. 4 (3), 372-397 (2005).
  4. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid Iterative Negative Geotaxis (RING): a New Method for Assessing Age-related Locomotor Decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  5. Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. 61, 3791 (2012).
  6. Long, T. A., Rice, W. R. Adult locomotor activity mediates Intralocus sexual conflict in a laboratory-adapted population of Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 274 (1629), 3105-3112 (2007).
  7. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotor in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. 24 (24), 1096 (2009).
  8. Marden, J. H., Rogina, B., Montooth, K. L., Helfand, S. L. Conditional tradeoff between aging and organismal performance of Indy long-lived mutant flies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (6), 3369-3372 (2003).
  9. Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, L. Simultaneous tracking of fly movement and gene expression using GFP. BMC Biotechnol. 8, 93 (2008).
  10. Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, J. Simultaneous tracking of movement and gene expression in multiple Drosophila melanogaster flies using GFP and DsRED fluorescent reporter transgenes. BMC Res Notes. 2 (58), 1-11 (2009).
  11. Ardekani, R., et al. Three-dimensional tracking and behaviour monitoring of multiple fruit flies. J. R. Soc. Interface. 10 (78), (2013).
  12. Branson, K. A., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  13. Zou, S., et al. Recording Lifetime Behavior and Movement in an Invertebrate Model. PLOS One. 6 (4), (2011).
  14. Valente, D., Golani, I., Mitra, P. P. Analysis of the trajectory of Drosophila melanogaster in a circular open field arena. PLoS One. 2 (10), 1083 (2007).
  15. Inan, O. T., Marcu, O., Sanchez, M. E., Bhattacharya, S., Kovacs, K. T. A portable system for monitoring the behavioral activity of Drosophila. J Neurosci. Methods. 202 (1), 45-52 (2011).
  16. Parashar, V., Rogina, B. dSir2 mediates the increased spontaneous physical activity in flies on calorie restriction. Aging. 1 (6), 529-541 (2009).
  17. Kaneuchi, T., Togawa, T., Matsuo, T., Fuyama, Y., Aigaki, T. Efficient measurement of H2O2 resistance in Drosophila using an activity monitor. Biogerontology. 4 (3), 157-165 (2003).
  18. Carey, J. R., et al. Age-specific and lifetime behavior patterns in Drosophila melanogaster and the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Exp. Gerontol. 41 (1), 93-97 (2006).
  19. Rhodenizer, D., Martin, I., Bhandari, P., Pletcher, S. D., Grotewiel, M. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp. Gerontol. 43 (8), 739-749 (2008).
  20. Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (22), 12596-12601 (2001).
  21. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  22. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. 43, 2157 (2010).
  23. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protoc. 11, (2010).
  24. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. . Processing circadian data collected from the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Protoc. 11, (2010).
  25. Ardekani, R., Tavaré, S., Tower, J. Assessing senescence in Drosophila using video tracking. Methods Mol. Biol. 965, 501-516 (2013).
check_url/de/51449?article_type=t

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449, doi:10.3791/51449 (2014).

View Video