인간 호중구 유량 용기 접착 분석

이 연구를 위해 모집 모든 기증자가 서면 동의를 준 연구는 버밍엄 기관 평가위원회에서 알라바마의 대학에 의해 승인되었습니다. 1. HUVEC 초기 문화와 서브 컬쳐 내피 세포의 기초 배지 구성되어 완전한 성장 배지에서 체외 배양 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 내피 세포 성장 인자로 보충 (자재 목록 참조). 참고 :이 연구에 사용 된 성장 요인은 다음을 포함한다 : 5 NG / ML 인간 재조합 표피 성장 인자 (hEGF), 1.0 ㎎ / ㎖의 하이드로 코티손, 50 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 및 50 NG / ML 암포 테리 신-B (GA-1000), 2 % 태아 소 혈청 (FBS), 0.5 NG / ML 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 10 NG / ML 인간 섬유 아세포 성장 헤파린 (hFGF-B)와 인자 – 기본, 20 NG / ML 인간 재조합 인슐린과 같은 성장 인자 ( R 3-IGF-1) / ㎖ 아스코르브 산 1 μg 및 22.5 ㎍ / ml의 헤파린. 완전 배지37 ° C에서 처음에 준비하고 준비 1 개월 이내에 사용하기 위해 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 세포의 플라스크를 준비하려면, 전체 성장 매체는 75 ㎠의 조직 배양 플라스크 (1 ㎖ / 5cm 2)에 다음 플라스크의 배양기에서 37 ° C / 5 % CO 2 평형을 허용 추가 적어도 30 분. 인간은 HUVEC / cm 2 2,500-5,000 세포의 밀도로 평형화이 배양 플라스크에 직접 파종한다. 미디어가 평형을하는 동안 신속하게 37 ° C의 물을 욕조에 주식 HUVEC의 cryovial을 해동. 볼 텍싱에 의해 일본어 저장 바이알 세포를 분산하고 / cm 2 2,500-5,000 세포 밀도를 달성하기 위해 미리 평형화 HUVEC 완전 성장 배지를 함유하는 배양 플라스크에 직접 추가. 부드럽게 골고루 세포를 배포 한 후 인큐베이터에 플라스크를 반환하는 플라스크 바위. 이 세포는 현재 1 차 통과를 나타냅니다. <세포를 70 ~ 80 % 년 합류 할 때까지 리> 보통은 이틀마다 변경해야합니다. HUVEC를 지금 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 문화 플라스크에서 수확 할 수있다. 배양 배지는 세포에서 남아있는 단백질과 칼슘을 제거하는 PBS 린스 다음에 배양 플라스크에서 흡입됩니다. 0.25 % 트립신-EDTA 용액을 첨가하고, 광학 현미경에 의해 평가로 2-6 분의 세포 분리에서 분명해야한다. 세포의 90 %가 플레이트 오프 반올림되는 경우, 2X 트립신 억제제의 동량을 첨가함으로써 트립신을 멈춘다. 세포 수확을 용이하게하기 위해, 완전 성장 배지의 다른 동등한 양을 추가한다. 멸균 15 ML의 원심 분리기 튜브에 분리 된 세포를 전송합니다. 실온에서 5 분 동안 225 XG에서 분리 된 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음하고 완전한 성장 매체의 2 ~ 3 ㎖의 세포를 재현 탁. hemacytometer와 트리 판 블루를 사용하여 세포 농도 및 생존 능력을 결정합니다. 일을 사용하려면전자 연구를위한 세포, 다시 씨앗 추가 75cm / ㎠ 10,000 세포의 밀도로 세포 2 플라스크를 수확하고 2.2 단계로 진행합니다. 또한, 세포는 미래의 연구를 위해이 시점에서 고정 할 수 있습니다. 냉동 세포를 들어, 실온에서 5 분 동안 225 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 상등액 대기음하고 1 × 106 세포 / ml의 농도에서 10 %의 DMSO를 함유 FBS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 세포 현탁액을 세포 냉동 컨테이너에 세포를 고정한 후 cryovials에 옮기고 -80 ° C에 저장된다. 2. HUVEC 계층 준비 냉동 2 차 통과 된 HUVEC의 사용 : 부흥과 문화. 적극적으로 성장하는 세포를 사용하는 경우, 2.2 단계로 진행합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 신속하게 단계를 1.8에서 2 차 통과 된 HUVEC을 포함하는 cryovial을 해동. 15 ㎖의 멸균 원심 분리 관에 cryovial 세포를 전송하고 10 ㎖ 성장 메디 추가음. 상온에서 5 분 200 XG에서 세포를 원심 분리기 및 잔류 DMSO를 제거 뜨는을 대기음. 완전 성장 배지로 세포 펠렛을 재현 탁하고 75cm 2 플라스크에 세포를 옮긴다. 전체 볼륨에 대한 20 ~ 25 ml로 성장 매체를 추가하고 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어. 시각 매체의 변화 이틀에 하루에 합류하기위한 세포 배양을 검사합니다. 보통 2 ~ 4 일 이내에, 세포들은 흐름 챔버 분석에 사용하기위한 준비가 될 것입니다 어떤 시간에 80~90% 합류에 도달 할 것입니다. 유량 용기에 사용되는 배양 접시를 준비하려면 (5 장 참조), 수 있도록 10 ㎍ / ml의 피브로넥틴 1 ㎖와 0.05 % 35mm 조직 문화 요리와 피펫 (w / v)의 젤라틴을 여러 번 추가 확인 전체 플레이트 표면은 코팅되어있다. 단백질 매트릭스 형성을 최적화하기 위해 최소 30 분 동안 접시를 건조 과도한 피브로넥틴과 젤라틴 용액과 공기를 제거합니다. Fibronectin 젤라틴 용액을 10 배까지 재사용 할 수있다. 단계 1.5-1.7의 설명에 따라 트립신-EDTA를 이용하여 단계 2.2에서 HUVEC 세포를 수확. 각 코팅 조직 배양 접시에 50 만 셀을 시드. 각 접시에 2 ㎖ 성장 매체를 추가하고 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어. 세포 단계 2.2에서와 같이 합류로 성장할 수 있습니다. 세포는 시각 매체의 변화 이틀 매일 점검해야한다. 이전 유량 용기의 분석에, 접착 분자 발현을 상향 조절하고 자극하는 4 ~ 6 시​​간 동안 20 NG / ML 인간 TNF-α와 HUVEC 총리. 3. 정화 리간드 코팅 35mm 조직 배양 접시의 중앙에 마커 또는 펜으로 0.5 cm 직경의 원을 그립니다. 표시된 지역에서 20 ㎍ / ㎖의 단백질의 판 (20) μL. 단백질에게 0.5 cm 직경의 원 안에 전체 영역을 커버하는 솔루션을 확산 피펫 팁을 사용합니다. 그것은 D의 표면을 만지거나 긁지하는 것이 중요하다ISH. 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. 1 ㎖의 PBS (산도 8.0)와 단백질 코팅 된 플레이트의 3 배를 씻으십시오. 비 특정 판에 바인딩을 차단하기 위해 표시된 부분의 판 (50) ㎕의 1 % BSA. 4 ℃에서 2 시간 동안 배양 단계 3.3에서와 같이 1 ㎖의 PBS 차단 판의 3 배를 씻으십시오. 코팅 구단 유착 수용체 리간드 키메라 단백질 솔루션을 준비합니다. 이 실험에서, 25 ㎍ / ml로 ICAM-1/Fc 키메라 PBS 용액 및 0.5 ㎍ / ml로 P-Selectin/Fc 키메라는 (산도 8.0)을 사용 하였다. 코트 기판의 50 μL로 표시된 부분. 4 ℃에서 하룻밤 배양한다 접시 2 일 이내에 사용되어야하며, 코팅 된 지역은 건조하도록 허용 할 수 없습니다. 접시에 50 μL 솔루션을 유지하기 위해 필요한 경우 PBS를 추가합니다. 4. 호중구 분리 (실내 온도에서 수행되는 모든 단계) 동의를 얻은 후, 정맥 절개에 의해 참가자의 혈액을 수집N 항 응고 혈관 또는 vacutainer (EDTA 또는 헤파린). 채혈 후 분리하기 전에 PBS와 혈액 1:1 희석. 50 ㎖ 원심 분리기 튜브에 PBMC 및 호중구를 분리하는 2 개의 층 피콜를 준비합니다. 처음 15 ㎖의 헤비 피콜 (재료의 목록, ρ = 1.118-1.120 참조)에 추가 한 다음 조심스럽게 10 ㎖ 무거운 피콜 위에 (재료의 목록, ρ = 1.077-1.080 참조) 피콜 빛 층. 빛 피콜 무거운 피콜 층 사이에 날카로운 경계가 있어야합니다. 마지막으로,주의 깊게 피콜 층을 방해하지 않고 빛 피콜 위에 희석 된 혈액 샘플 25 ㎖ 레이어. 실온에서 30 분 동안 250 XG에서 튜브를 원심 분리기. 주의 : 이러한 스핀은 원심의 끝에서 로터 감속시의 세포 분리의 잠재적 인 방해를 최소화하기 위해 원심 로터 브레이크가 해제되어야한다. 원심 분리 후, (위에서 아래로) 다음의 층 존재 : 상부 층은 플라즈마 FOLLO이며광 피콜 층 위에 PBMC 층에 의해 물, 약간의 적혈구 (RBC)와 호중구 층은 튜브의 바닥에서 무거운 피콜 층과 적혈구이어서 가볍고 무거운 피콜 사이​​이다. 수확하고, 전송 피펫으로 새로운 50 ㎖ 튜브에 호중구 계층 전송을 실온에서 10 분 동안 225 XG에 50 ㎖ 원심 분리기의 최종 부피 PBS를 추가. 원심 분리 후, 여전히 호중구와 혼합 적혈구가있을 수 있습니다. 아래로 10 ㎖ 마크 뜨는을 대기음. 튜브 (또는 간단한 저속 소용돌이로 교반)의 부드러운 교반 호중구 RBC 펠렛을 재현 탁하고 PBS 50 ㎖로 다시 세척한다. 두 번째 세척 후, 뜨는을 대기음. , 오염 적혈구를 제거 교반 (또는 짧은 소용돌이로 교반)에 의해 잔류 PBS의 펠렛 세포를 재현 탁하려면 25 ML의 H 2 O 및 RBC를 용해하는 10 초 동안 부드럽게 소용돌이를 추가합니다. 1.8 % 염화나트륨 25 mL를 넣고 즉시 혼합실온에서 10 분 동안 225 XG에서 원심 분리함에 따라. 오염 RBC는 이제 흰색 호중구 세포 펠렛을 떠나 용해되어야한다. PBS와 호중구 세포 펠렛을 씻으십시오. 10 % FBS와 RPMI 배지에서 격리 된 호중구를 재현 탁하고 혈구와 광학 현미경으로 세포 농도를 결정한다. 완전 RPMI-10 % FBS 배지로 500,000 세포 / ml의 세포 밀도를 조정한다. 5. 유량 용기 접착 분석 유량 용기를 조립합니다. 현미경 테이블에 합류 HUVEC를 또는 정제 부착 수용체 리간드를 포함하는 35mm 접시를 놓습니다. 주사기 펌프, 진공 시스템과 병렬 플레이트 흐름 챔버를 연결하고 호중구 입력 오픈 한 줄을 둡니다. 접시 위에 유량 용기를 삽입하고 유량 용기 조립체 (13)를 고정합니다. (그림 1 참조) 컴퓨터 연결된 t에 녹화 프로그램을 시작현미경 오. 완전히 성장 HUVEC 세포와 명확한 필드 또는 리간드 코팅 영역을 볼 수 있습니다 내에서 필드까지 현미경의 필드와 초점을 조절합니다. 주사기 펌프를 사용하여, RPMI 배지로 유동 챔버를 헹군다. 챔버 내의 기포 또는 호중구 입력 라인이 없는지 확인합니다. 원하는 경우, 호중구는 10 분 동안 낮은 복용량 (10 -8 M) fMLP으로 뇌관을 할 수있다. 이것은 다른 기증자 (14) 사이의 호중구 활성화의 기초 수준의 일치를 허용합니다. 정의 속도 유량 용기에 (이 연구에서 사용되는 / ㎠ 1.5 다인의 전단 응력과 동일 350 μL / 분의 속도) 호중구를 주입하는 주사기 펌프를 사용합니다. 영상을 기록합니다. 호중구 밀착성이 빠르게 일어날 수 있으므로, 4-5 분의 길이는 비디오 분석을 위해 점착 이벤트를 정량하는 것이 충분하다. 부착 성 세포는 이하 기포 직경을 이동 셀로서 정의된다HUVEC 또는 리간드 코팅 된 표면 (15, 16)에 5 초 이내. 이 규칙을 사용하여 기록 된 영상 내에 존재하는 필드에 부착 세포의 총 수를 센다. 다른 기증자 호중구와 비슷한 길이의 동영상을 기록하여, 하나는 다른 기증자 사이의 접착 특성을 비교하기 위해 부착 세포 / 분을 계산할 수 있습니다.