人中性粒细胞流动室粘附实验

招募本研究所有捐助者签署知情同意书和研究经阿拉巴马大学伯明翰分校机构审查委员会。 1，血管内皮细胞初代培养和传代培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC） 在体外在由血管内皮细胞基础培养基中的完全生长培养基（见材料清单），补充有内皮细胞生长因子。 注：在本研究中使用的生长因子包括：5毫微克/毫升的人重组表皮生长因子（hEGF的），1.0毫克/毫升氢化可的松，50毫克/毫升庆大霉素和50毫微克/毫升两性霉素-B（GA-1000），2个％胎牛血清（FBS），0.5纳克/毫升的血管内皮生长因子（VEGF），10纳克/毫升的人类成纤维细胞生长因子基本与肝素（hFGF-B），20纳克/毫升的重组人胰岛素样生长因子（ R 3-IGF-1），1微克/毫升抗坏血酸和22.5微克/毫升肝素。完全培养基制备最初在37℃和然后可被储存在4℃下1个月的制剂中使用。 准备一个烧瓶中的细胞，完全培养基加入到75 厘米的组织培养烧瓶中（1毫升/ 5厘米2），然后将烧瓶使其平衡至37℃/ 5％CO 2的加湿培养箱中培养至少30分钟。人脐静脉内皮细胞将被直接接种到这个平衡的培养烧瓶中，在2,500-5,000细胞/ cm 2的密度。 虽然媒体是平衡，迅速解冻股票脐静脉内皮细胞冻存管在37℃水浴。通过涡旋使细胞分散在原始储存小瓶，然后将它们直接添加到含有预平衡的HUVEC完全生长培养基中以达到2500-5000个细胞/ cm 2的密度培养瓶中。轻轻摇动烧瓶以均匀分布的细胞，然后将烧瓶返回到培养箱中。这些细胞现在代表的第一通道。 <李>中应改为每两天，直到细胞70-80％汇合。 在内皮细胞，现在可以从培养瓶中用胰蛋白酶/ EDTA收获。培养基从培养瓶中后跟的PBS冲洗，以从细胞中除去任何残留的蛋白和钙吸出。 0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，并在2-6分钟细胞脱离所评估光镜应该是显而易见的。 当90％的细胞被四舍五入掉板中，加入2倍的胰蛋白酶抑制剂的等体积停止胰蛋白酶消化。为了便于细胞的收获，加入完全生长培养基的另一个等量。转移分离的细胞中的无菌15ml离心管中。 离心分离的细胞在225×g离心5分钟，在室温下进行。吸出上清液，然后重悬细胞在2-3完全生长培养基中。测定细胞浓度和存活率用血球计数器和台盼蓝。 利用日Ë收获细胞进行研究，重新播种额外75 厘米瓶与细胞以10,000细胞/ cm 2的密度，并继续执行步骤2.2。或者，细胞可以在此时被冻结为今后的研究。用于细胞冷冻，离心沉淀细胞，在225×g离心5分钟，在室温下进行。吸出上清，重悬细胞沉淀在含胎牛血清10％DMSO中以1×10 6个细胞/ ml的浓度。在细胞悬浮液中的细胞在细胞冷冻集装箱冷冻后，然后转移到冷冻管并储存于-80℃。 2，血管内皮细胞层的制备利用冷冻第二通道脐静脉内皮细胞：复兴与文化。如果使用生长活跃的细胞，进行步骤2.2。 含解冻迅速从1.8步在37℃水浴2 次通过脐静脉内皮细胞的离心管。从离心管转移细胞到15ml的无菌离心管中，并加入10 ml生长的Medi嗯。 离心细胞，在200×g离心5分钟，在室温下和吸出上清液，以除去残留的DMSO。 重悬细胞沉淀用完全生长培养基中，将细胞转移至75 厘米的烧瓶中。加生长培养基至总体积为约20-25毫升，孵育37℃/ 5％CO 2在。 每天目视检查的汇合细胞培养与媒体的变化，每两天。一般于2-4天，电池将达到80-90％汇合，届时他们将准备在流室法的使用。 要准备培养皿，将在流室中使用（见第5章），加入1毫升10微克/毫升纤维连接蛋白和0.05％（W / V）明胶为35 mm组织培养皿和吸管数次，使确保整个板表面涂。除去多余的纤连蛋白和明胶溶液和空气干燥该板为至少30分钟，以优化蛋白基质的形成。该fibronectin和明胶溶液可以重复使用高达10倍。 按照步骤1.5-1.7描述使用胰蛋白酶-EDTA从步骤2.2收获HUVEC细胞。种子500,000细胞到每个包被的组织培养皿中。加入2ml生长培养基中每道菜，并培育37℃/ 5％CO 2的。 使细胞生长至汇合，如步骤2.2。细胞应进行外观与媒介改变了每两天每天检查。在此之前的流室法，首要的HUVEC与20毫微克/毫升的人TNF-α的4-6小时上调，刺激黏附分子的表达。 3，纯化配体涂层吸取0.5厘米直径的一个圆在35毫米组织培养皿的中心标记或钢笔。 板20微升的标志区20微克/毫升的蛋白A。用枪头传播蛋白A的解决方案，以支付0.5厘米直径的圆内的整个区域。但千万不要触摸或刮伤D的表面是很重要的十岁上下。在37℃下1小时。 用1毫升的PBS（pH 8.0）中洗蛋白A涂板3次。 板加入50μl的1％BSA中的显着区域来阻止在板的非特异性结合。孵育2小时，在4℃下用1毫升的PBS中，如步骤3.3洗阻断板3次。 准备的Fc粘附受体配体嵌合蛋白溶液的涂层。在该实验中，一个ICAM-1/Fc的嵌合体溶液在25微克/毫升和P-Selectin/Fc嵌合体在PBS中0.5微克/毫升（pH8.0）中被使用。 大衣与50微升底物的显着区域。孵育过夜，在4℃下烹调应在两天内被使用，并且涂覆区域不应该被允许干燥。如果要保持上盘的50微升的溶液加入PBS。 4，中性粒细胞分离（在室温下进行所有步骤） 获得知情同意后，收集参与者的血液通过静脉切开成Ñ​​抗凝血液收集管或真空采血管（EDTA或肝素）。采血后，分离前稀释血液1:1的PBS。 准备一个两层聚蔗糖的50毫升离心管中分离外周血单个核细胞和中性粒细胞。首先添加15毫升沉重聚蔗糖（见材料清单，ρ= 1.118-1.120），然后仔细层10毫升光聚蔗糖（见材料清单，ρ= 1.077-1.080）在沉重的聚蔗糖的顶部。应的光聚蔗糖和沉重的Ficoll层之间的尖锐边界。最后，小心层25毫升稀释血样品上的光的Ficoll的顶部，而不会干扰的Ficoll层。 离心管中，在250×g离心30分钟，在室温下进行。注：该离心机转子制动应该关闭这些自旋尽量减少在转子减速的细胞分离的离心年底的潜在干扰。离心后，将下面的层（从顶部到底部）存在：顶层是等离子体福卢由PBMC层上的光的Ficoll层的顶部周三，嗜中性粒细胞层用少量的红血细胞（RBC）的轻和重的Ficoll随后在管的底部重的Ficoll层和红细胞之间。 收获和嗜中性粒细胞层转移到新的50ml管中有一个移液管，加PBS至50ml离心终体积在225×g下在室温下10分钟。 离心后，仍可能存在的RBC与嗜中性粒细胞混合。吸出上清液下至10ml刻度。通过管（或短暂低速涡旋）的温和搅拌悬浮的嗜中性粒细胞 – 红细胞沉淀，然后用50ml的PBS再次洗涤。 第二次洗涤后，吸出上清液。以除去污染的红细胞，通过搅拌（或短涡旋）重新悬浮沉淀的细胞中残留的PBS中，加入25毫升水2 O，轻轻涡旋10秒以裂解红细胞。 取25 mL 1.8％NaCl溶液中，并立即混匀通过离心分离，在225×g下在室温下10分钟。所述污染红细胞现在应该裂解留下白色中性粒细胞沉淀。 用PBS洗中性粒细胞的细胞沉淀。 重悬分离的嗜中性粒细胞在RPMI培养基中含有10％FBS，并确定光学显微镜用血细胞计数下将细胞浓度。 调整细胞密度至500,000个细胞/ ml用完全RPMI-10％FBS的培养基中。 5，流室粘附实验装配流动室。将包含在显微镜上表中的融合内皮细胞或纯化的粘附受体的配体35毫米的菜。连接平行板流动腔与注射泵，真空系统，留下一行开的中性粒细胞输入。将流动室上盘的顶部，并拧紧流室组件13。 （ 见图1） 启动电脑连接吨的视频录制程序Ø显微镜。调整显微镜的领域和焦点，直到一个明确的字段具有完全生长的HUVEC细胞或一个字段内的配体涂层区域是可见的。 使用注射泵，冲洗液流腔的RPMI培养基中。确保有室之内没有气泡或中性粒细胞输入线。 如果需要的话，嗜中性粒细胞可引发的低剂量（10 -8 M）的fMLP 10分钟。这将允许为不同的供体14之间的中性粒细胞活化的基础水平的匹配。 使用注射泵，以嗜中性粒细胞注入到流动室中限定的速度（350微升/分钟的速度，这等于1.5达因/厘米2的剪切应力是用在本研究中）。录制视频。因为中性粒细胞粘附可发生迅速，具有4-5分钟长度的视频通常是足够的定量粘附事件进行分析。 贴壁细胞被定义为移动小于1细胞直径的小区5秒内对血管内皮细胞或配体涂层表面15,16。计数贴壁细胞的总数量在该领域目前在使用这个法则录制的视频。通过记录长度相似的影片，不同的捐助者的嗜中性粒细胞，就可以计算出贴壁细胞/分钟比较不同供体之间的粘合性。