La matriz extracelular se somete a la remodelación sustancial durante la cicatrización de heridas, la inflamación y la tumorigénesis. Se presenta un novedoso enfoque de inmunofluorescencia microscopía intravital de visualizar la dinámica de fibrilar, así como componentes de la matriz de tipo malla con una alta resolución espacial y temporal mediante epifluorescencia o microscopía de dos fotones.
Además de ser un andamio física para mantener la morfología del tejido, la matriz extracelular (ECM) está activamente involucrada en la regulación de la función celular y de tejidos durante el desarrollo y la homeostasis de órganos. Lo hace, actuando a través de las vías de señalización bioquímicos, biomecánicos, y biofísicos, como a través de la liberación de fragmentos de proteínas ECM bioactivos, que regula la tensión del tejido, y proporcionar vías para la migración celular. La matriz extracelular del microambiente del tumor se somete a la remodelación sustancial, caracterizado por la degradación, deposición y la organización de proteínas de la matriz fibrilares y no fibrilares. Estroma de refuerzo del microambiente del tumor puede promover el crecimiento del tumor y la invasión, y causar la remodelación de los vasos sanguíneos y linfáticos. Formación de imágenes en vivo de proteínas de la matriz, sin embargo, a este punto está limitada a los colágenos fibrilares que pueden ser detectados por generación de segundo armónico mediante microscopía multifotónica, dejando la mayoría de los componentes de la matriz Largely invisible. Aquí se describen los procedimientos para la inoculación del tumor en la piel de la oreja dorsal fina, immunolabeling de las proteínas de la matriz extracelular y de imagen intravital del tejido expuesto en ratones vivos mediante epifluorescencia y microscopía de dos fotones. Nuestro método intravital de imágenes permite la detección directa de tanto fibrilar y proteínas de la matriz no fibrilares en el contexto de un tumor dérmico creciente. Mostramos ejemplos de remodelado vascular causada por la contracción de la matriz local. También se encontró que la matriz fibrilar del tumor detectado con la segunda generación de armónicos es espacialmente distinta de componentes de la matriz recién depositados tales como tenascina C. También mostramos a largo plazo (12 horas) de formación de imágenes de la interacción de células T con células tumorales y las células tumorales la migración a lo largo del colágeno IV de la membrana basal. Tomados en conjunto, este método permite de forma única para la detección simultánea de las células tumorales, su microambiente físico y la respuesta inmune tejido endógeno con el tiempo, lo que puede provide importantes conocimientos sobre los mecanismos subyacentes a la progresión del tumor y el éxito o la resistencia a la terapia definitiva.
Intravital de imágenes de enfermedades inflamatorias, metastásicos y los procesos de remodelación de la matriz ha sido un área importante de la investigación y ha motivado la creación de numerosos modelos de ratones transgénicos reportero que expresan proteínas fluorescentes 1,2. Debido a las señales de fuera de foco fluorescentes, que reducen la calidad de la imagen y los límites de penetración de la luz a través del tejido, tejido grueso de formación de imágenes es posible sólo con confocal o microscopía de barrido de múltiples fotones 3. Usando más rápido, menos caro y complejo microscopía de epifluorescencia es posible sólo con los tejidos casi de dos dimensiones, tales como la membrana corio-alantoideo de pollo 4 o la dermis del oído de ratón 5. La mayoría de los sistemas de imagen se aprovechan de ratones transgénicos que expresan diferentes proteínas fluorescentes de una manera específica del tipo celular. A pesar de que estas proteínas ofrecen fototoxicidad débil, que inducen la respuesta inmune 6. Además, es difícil cambiar entre subtipos celulares específicos o marcar elbasal ir o estados activados como tal cambio requiere la preparación de un nuevo modelo genético. Además, como expresión de la proteína fluorescente se restringe generalmente al compartimiento intracelular, por lo general no es posible imagen estructuras extracelulares, como las proteínas de la membrana basal o depósitos de quimioquinas tejido 7. En lugar de ello, el marcaje indirecto con anticuerpos contra antígenos extracelulares ofrece flexibilidad para prácticamente cualquier tipo de célula o matriz de componentes específica 8,9. Sin embargo, la principal desventaja de este enfoque de etiquetado se asocia con la inmunotoxicidad mediada por complejos inmunes antígeno-anticuerpo que pueden desencadenar complemento toxicidad celular dependiente del sistema y la fagocitosis de las células y estructuras extracelulares 10.
La matriz extracelular del microambiente del tumor, sino también de tejido normal durante la inflamación o la curación de heridas, se somete a la remodelación sustancial. Estroma de refuerzo del microambiente del tumor puede promoel crecimiento del tumor y la invasión TE debido a los mecanismos de señalización inducidas por el estrés y causa la remodelación de la sangre y los vasos linfáticos 11. Sin embargo, de formación de imágenes en vivo de proteínas de la matriz está limitada a los colágenos fibrilares que pueden ser detectados por generación de segundo armónico mediante microscopía de múltiples fotones. Recientemente hemos publicado un nuevo método intravital de imágenes que reduce al mínimo el riesgo de daños foto-y-inmune tóxico para las células fotografiados y las estructuras de tejido 5. En comparación con las técnicas de imagen establecidos donde la única ronda de visualización intravital continua está en un intervalo de 30 minutos a 2 horas 12-17, nuestra técnica (SI) de inmunofluorescencia intravital permitió 12 horas (a largo plazo 8) de formación de imágenes. Es importante tener en cuenta que el tiempo de formación de imágenes se limita a 12 horas debido a los límites definidos en el protocolo de los animales, pero no hay contra-indicaciones técnicas que no se puede prolongar si los parámetros críticos de la salud del animal, como la presión arterial y el corazóntasa se controlan 8. Además, mediante el uso de un microscopio estereoscópico de fluorescencia automatizado pudimos recoger imágenes de varios campos en un solo experimento y observamos raros procesos inmunológicos y remodelación que se produjeron en el contexto fisiológico de la piel con el apoyo de la sangre funcionales y vasos linfáticos. Debido a que la lente estereomicroscópica tiene una relativamente grande, 2 cm, distancia de trabajo y en contraste con dos fotones ópticas microscópicas no requiere vaporización inmersión en agua, tratamiento de imágenes a largo plazo se realiza sólo bajo microscopio estereoscópico de fluorescencia. Intravital Si se permite el etiquetado inmune y la detección de cualquier componente de la matriz extracelular de la piel normal. El diseño de esta técnica se basa en el concepto innovador de la utilización de la inmunotinción de las células vivas y los elementos de la matriz del tejido de la dermis de ratones expuestos quirúrgicamente sin causar efectos dañinos inmunotóxicas 5. El procedimiento quirúrgico en sí es seguro a la dermisvasculatura ya que se basa sólo en la separación de dos capas de la piel en el oído que se inervado de forma independiente, de manera autónoma alimentada por la sangre y drenado por circulaciones separadas linfáticos. Nuestro sistema experimental permite obtener imágenes de una serie de eventos fisiopatológicos importantes sobre al menos 12 horas, incluyendo el tráfico de leucocitos entre los vasos sanguíneos y linfáticos y los procesos de cicatrización de heridas. En la publicación original, comparamos nuestra técnica con los estándares del estado de la técnica en diversos campos de la imagen intravital. En consecuencia, se observó la extravasación de los vasos sanguíneos y linfáticos eventos intravasation por varios tipos de leucocitos, incluyendo la visualización única de las células inmunes que entran en la recogida en lugar de esperar vasos linfáticos iniciales 15. Además, como complemento de las observaciones hechas por otros grupos 9,18, encontramos que en CCL21 in vivo es capaz de formar depósitos fuertes, discontinuos en la recogida, pero sólo con poca frecuencia en los linfáticos iniciales.
<p class = "jove_content"> Aquí se describe un intravital modificado SI técnica que se puede combinar con la microscopía de dos fotones para detectar la red de colágenos fibrilares que utilizan generación de segundo armónico (SHG). Se demuestra que este método también se puede utilizar para la invasión de células de cáncer de formación de imágenes en el contexto del microambiente del tumor dinámico, que incluye moléculas de la matriz tales como la tenascina C, que son en gran parte sin explorar por técnicas de imagen actuales 19. Se encontró que la matriz fibrilar del tumor, detectado con la segunda generación de armónicos, ocupa diferentes lugares del microambiente del tumor que la matriz recién depositada compuesta de tenascina C. Además, se describen ejemplos de remodelado vascular causadas por la contracción de la matriz local, de larga- plazo (12 horas) de formación de imágenes de las interacciones de células T con las células tumorales y la migración de células del tumor a lo largo de colágeno IV de la membrana basal. Este tipo de eventos se pueden obtener imágenes durante la grabación simultánea de parámetros fisiológicos locales, como pe los vasos sanguíneosrmeability y el drenaje linfático.Significado
Aquí se presenta un enfoque novedoso microscopía intravital que permite una alta resolución y visualización dinámica de los diferentes componentes del microambiente del tejido, incluyendo fibrilar, así como proteínas de la matriz de tipo malla. Este método tiene varias ventajas sobre las técnicas actuales de formación de imágenes intravital: (i) de imágenes de fluorescencia intravital se ha utilizado en estudios de la microcirculación, por ejemplo, para realizar un seguimiento soluto fugas de la sangre o en los vasos linfáticos, pero no se ha combinado con la inmunotinción. (Ii) El empleo de reportero ratones modificados genéticamente permite determinados tipos de células para ser fotografiados, pero requiere de la disponibilidad (o esfuerzo sustancial para crear otras nuevas) y limita el número de interactuar tipos de células que se pueden estudiar. (Iii) La matriz extracelular se pueden obtener imágenes in vivo utilizando segunda generación de armónicos, pero esta técnica sólo puede detectar colágenos fibrosos, dejando un gran número de componentes extracelulares importantestales como las membranas basales, fibronectinas, tenascinas, factores de crecimiento, quimiocinas y glicosaminoglicanos tejido fuera del alcance de la investigación actual. Nuestro método supera estas limitaciones, y permite que las técnicas de imagen estándar para ser incorporados y más combinan con inmunotinción para otros tipos de células, estructuras de tejido, los depósitos de sulfato de heparina de unión de factores de crecimiento (por ejemplo VEGF 26) y quimiocinas (CCL21 y 5,18. Fig. 2D ), o proteínas de la matriz extracelular mientras que el seguimiento de forma simultánea en la sangre y / o en los flujos linfáticos.
Limitaciones
La formación de imágenes de epifluorescencia intravital de SI se limita a los colgajos de piel delgadas, privados de hipodermis gruesas (tejido adiposo). Si bien hemos encontrado que la dermis del oído dorsal es óptima para la exposición quirúrgica relativamente inofensiva de la piel de la oreja, con epifluorescencia intravital SI técnica no se limita a la dermis del oído y potencialmente se podrían aplicar a por ejemplo,la piel expuesta de los dedos del pie o la piel de la espalda del ratón recién nacido. Tinción de anticuerpos rápida (15 minutos) en inmunofluorescencia SI no depende de la difusión pasiva, sino que requiere el drenaje linfático funcional y el flujo de fluido intersticial, por lo tanto, ninguna tinción se puede observar si los vasos linfáticos se ocluyen 27. En línea con esto, los vasos linfáticos se tiñen más fuerte vasculatura sanguínea luego gotea (vasos lesionados, arteriolas) 5. La separación de la dorsal y ventral del oído colgajos de piel es un procedimiento quirúrgico leve pero causa daño a algunos capilares y la muerte celular a diversas células del tejido. Esto podría ser un problema cuando se necesita investigar tejido completamente intacto, por ejemplo, en términos del efecto leve de medicamentos sobre la supervivencia celular. También la aplicación de antioxidante que sirve para proteger la piel de la fototoxicidad y fotoblanqueo excluye el uso de la técnica de inmunofluorescencia intravital para estudiar por ejemplo, el estrés oxidativo de tejidos o Biolog óxido nítricoY.
Por último, el cegamiento de los macrófagos residentes del tejido con complejos inmunes puede activar estas células y la influencia por ejemplo el estudio de la respuesta inmune del tejido y la activación de células dendríticas.
Modificaciones y solución de problemas
Con el fin de estudiar el estrés oxidativo del tejido o de la biología óxido nítrico, ascorbato tiene que ser reemplazado con otros medios de comunicación compatible con los tejidos que no interfiera con la salida experimental. Del mismo modo, los receptores de Fc de bloqueo en las células inmunes dérmicos deben evitarse si el objetivo del estudio es la función y la activación de la respuesta inmune de tejido y activación de células dendríticas y la migración. Esto se puede hacer con el uso de anticuerpo secundario con fragmento Fc troceados (F (ab) 2 de anticuerpos) o el uso de anticuerpo biotinilado y estreptavidina fluorescente como reactivos de detección.
Las aplicaciones futuras
Presentamos un intra novedoso y únicovital si la técnica para obtener imágenes de los componentes no fibrilares de la matriz extracelular en tumores de piel trasplantables en combinación con fibrilar detectado-SHG y colágenos madurado utilizando microscopía de dos fotones. Una de las ventajas de la utilización de múltiples fotones (o confocal) de formación de imágenes de microscopía de epifluorescencia sobre posibilidad es-Z apilamiento y en consecuencia espacial co-localización de los eventos que ocurren dentro de la matriz extracelular, por ejemplo, la intravasación tumoral en linfático o vaso sanguíneo, que en el caso de los microscopía de epifluorescencia estándar puede ser sólo inferirse de cambios morfológicos de la célula invasora. Esta técnica tiene un potencial mucho más amplio. Por ejemplo, hemos utilizado la intravital SI para investigar el mecanismo de la oclusión linfático mediante terapia fotodinámica-linfático específico 27. Aplicaciones potenciales adicionales de este método incluyen, pero no se limitan a la investigación de la inmunidad de la piel durante la inflamación, el mecanismo de rechazo o métodos de la sangre y la linfa trasplante crecimiento de los vasos ática durante la tumorigénesis.
Los pasos críticos en el procedimiento
El paso más importante que tiene implicaciones críticas para el mantenimiento de un entorno de tejido fisiológico es una separación quirúrgica de la piel ventral y el cartílago de la dermis dorsal. Cortar u ocluir el principal arteria o vena dará lugar a un sangrado excesivo e hipoxia tisular local, lo que afectará a la respuesta celular a los tratamientos y el movimiento celular 8. Inmovilizar el oído con pegamento quirúrgico se debe hacer con cuidado ya que se derrame el pegamento en exponer el tejido causará una lesión permanente en el tejido por la oclusión de los vasos sanguíneos. La temperatura del ratón debe ser controlado y se mantiene a 37 ° C. Además, oxígeno humidificado necesita ser utilizado para la anestesia con isoflurano, de manera que los ojos y los pulmones se mantienen adecuadamente humidificado durante el experimento. Además, el ascorbato de sodio debe prepararse justo y su pH comprobado antes de su uso.
ntent "> En resumen, este inmunofluorescencia intravital puentes en tiempo real, las mediciones locales de la función fisiológica con imagen molecular de eventos celulares complejos en la piel de ratón. Además, este método tiene un gran potencial, ya que puede ser fácilmente aplicado a, por ejemplo estudio post-desarrollo mecanismos de sangre y la linfa-angiogénesis o para visualizar las primeras fases de la infección de la piel por diversos agentes patógenos. Con su flexibilidad y alto potencial de rendimiento, esta técnica intravital pueden contribuir significativamente a múltiples campos de la biología.The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a Jeremy CM Teo y S. Ryan Oliver por su contribución y Jolanta Kilarska para la ayuda en el procesamiento de imágenes. Damos las gracias a la facilidad de la base BIOP at EPFL por el apoyo con microscopía de dos fotones
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Comisión Europea de Investigación (DC-linfático, 206653-2), el Proyecto Marco Europeo de 7 (AngioScaff), la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (31-135756), y los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos (NIH) / NIH Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI) (SR1 HL096539). Además, los fondos del Premio Robert Wenner (Cáncer Liga Suiza) permitió la compra del microscopio estereoscópico Leica utilizado en este estudio. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |