Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung
Summary
Das hierin beschriebene Protokoll zielt darauf ab, zu erläutern und verkürzen die zahlreichen Hindernisse in den Weg der komplizierten Weg führt zu modifizierten Nukleosidtriphosphaten. Folglich dieses Protokoll erleichtert sowohl die Synthese dieser aktiviert Bausteine und ihre Verfügbarkeit für die Praxis.
Abstract
Die traditionelle Strategie für die Einführung von chemischen Funktionalitäten ist die Verwendung von Festphasensynthese durch Anhängen geeigneter Weise modifizierten Phosphoramidit-Vorläufern zu der entstehenden Kette. Jedoch sind die bei der Synthese und der Beschränkung auf eher kurze Sequenzen verwendeten Bedingungen behindern die Anwendbarkeit dieser Methode. Auf der anderen Seite werden modifizierte Nukleosidtriphosphate Bausteine, die für die leichte Einführung zahlreicher funktioneller Gruppen in Nukleinsäuren, eine Strategie, die den Weg für die Verwendung von modifizierten Nukleinsäuren in einer weitreichenden Palette von praktischen Anwendungen verwendet worden sind, ebnet aktivierten wie funktionelle Tagging und Generierung von Ribozymen und DNAzyme. Eine der größten Herausforderungen liegt in der Komplexität der Methode, die zur Isolierung und Charakterisierung dieser Nukleosid-Analoga.
In diesem Video-Artikel, ein ausführliches Protokoll für die Synthese von thes präsentieren wire modifizierten Analoga mit Phosphor (III)-basierenden Reagenzien. Darüber hinaus wird das Verfahren für ihre biochemische Charakterisierung weitergegeben, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Primerverlängerungsreaktionen und TdT Tailing-Polymerisation. Diese detaillierte Protokoll wird für die Verwendung des Handwerks von modifizierten dNTPs und ihre weitere Verwendung in der chemischen Biologie sein.
Introduction
5'-Nukleosid-Triphosphate ((d) Hohlstunden) stellen eine Klasse von lebenswichtigen Biomolekülen, die in zahllosen Prozessen und Funktionen, angefangen davon, dass die universelle Währung der Energie, um Regulatoren der Zellstoffwechsel beteiligt sind. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei dieser grundlegenden biologischen Veränderungen, ihre modifizierten Gegenstücke als vielseitiger und leichter Plattform für die Einführung von funktionellen Gruppen in Oligonukleotide, einer Methode, die gut ergänzt die automatisierte Festphasensynthese, die normalerweise angewendet wird 1,2 schoben. Ja, vorausgesetzt, die (d) Hohlstunden können als Substrate für RNA-und DNA-Polymerasen 3, eine Fülle von Funktionsgruppen einschließlich Aminosäuren 4-13, Boronsäuren 14,15, nornbornene 16, diamantartige Rückstände 17, Seitenketten für handeln Organokatalyse 18, Gallensäuren 19 und sogar 20-Oligonukleotide können in Oligonukleotide eingeführt werden.
_content "> Darüber hinaus repräsentiert eine günstige Vektor für die Funktionalisierung von Nukleinsäuren können modifiziert dNTPs in SELEX und andere kombinatorische Verfahren der in vitro-Selektion für die Erzeugung von modifizierten katalytischen 21-30 Nukleinsäuren und Aptamere für verschiedene praktische Anwendungen 10 in Eingriff gebracht werden, 31-36. Die zusätzlichen Seitenketten, die durch die Polymerisation der modifizierten dNTPs eingeführt werden, werden gedacht, um den chemischen Raum, die bei einem Selektionsexperiment erforscht werden können und ergänzen die eher schlechte funktionelle Arsenal von Nukleinsäuren 37 zu erhöhen. Trotz dieser attraktiven Eigenschaften und die jüngsten Fortschritte in der Entwicklung der beiden synthetischen und analytischen Methoden gemacht, keine allgemein gültige und hochverzinslichen Verfahren besteht für die Crafting-modifizierter Nucleosidtriphosphaten 2,38.Ziel dieses Protokolls ist es, Licht in die (manchmal) komplizierte Verfahren, die t Schuppeno Die Synthese und biochemische Charakterisierung dieser aktivierten Bausteine (Abbildung 1B). Besonderer Wert wird auf alle synthetischen Details, die oft schwer zu finden oder nicht vorhanden sind in der experimentellen Abschnitte sind aber noch entscheidend für den erfolgreichen Abschluss des synthetischen Weg führt auf die Isolierung von reinem (d) Hohlstunden (Abbildung 1) gegeben werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Einbeziehung von Änderungen in Nukleinsäuren ist von Interesse für viele praktische Anwendungen, einschließlich der Entwicklung von Antisense-und Antigen-Mittel 42,43, Kennzeichnung und Funktions Tagging von Oligonukleotiden 41 und bei den Bemühungen um die genetische Alphabet 44-46 ausbauen. Die chemischen Änderungen und Funktionsgruppen werden in der Regel durch die Anwendung von Standard-und automatisierte Festphasensynthese Protokolle in Nukleinsäuren eingeführt. Allerdin…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Schweizerischen Nationalfonds (Grants Nr. PZ00P2_126430 / 1 und PZ00P2_144595) unterstützt. Prof. C. Leumann ist dankbar für die Bereitstellung der Laborflächen und Geräte, sowie für seine ständige Unterstützung. Frau Sue Knecht ist für fruchtbare Diskussionen.
Materials
| tributylammonium pyrophosphate | Sigma Aldrich | P8533 | Hygroscopic solid, keep under Ar |
| 2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one | Sigma Aldrich | 324124 | Moisture sensitive |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 82704 | Under molecular sieves |
| Dioxane | Sigma Aldrich | 296309 | Under molecular sieves |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 40248 | Under molecular sieves |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90342 | |
| Tributylamine | Sigma Aldrich | 90781 | |
| ddH2O | Milli-Q | deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC) | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | 159220 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-25 | |
| Biochemical reagents | |||
| g-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| Natural dNTPs | Promega | U1420 | |
| Vent (exo–) DNA polymerase | NEB | M0257S | |
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | MO210S | |
| 9°Nm DNA polymerase | NEB | MO260S | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA polymerase | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarose | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Equipment | |||
| Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| PCR vials | Bioconcept | 3220-00 | |
| HPLC system | Amersham Pharmacia Biotech | Äkta basic 10/100 | |
| Oligonucleotides | |||
| All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1 | |||
| 5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1 | |||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles: | |||
| Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330 | |||
| Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F. |
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