نوكليوزيد Triphosphates - من توليف لتوصيف الكيمياء الحيوية
Summary
بروتوكول الموصوفة هنا يهدف إلى شرح وينتقص من العقبات العديدة في طريق المسار المعقدة مما يؤدي إلى triphosphates نوكليوزيد تعديل. بالتالي، هذا البروتوكول يسهل على حد سواء تركيب هذه بناء كتل تنشيط وتوافرها للتطبيقات العملية.
Abstract
الاستراتيجية التقليدية لإدخال وظائف الكيميائية هو استخدام تركيب الحالة الصلبة بإلحاق السلائف phosphoramidite تعديلها لسلسلة الوليدة. ومع ذلك، فإن الظروف التي استخدمت خلال عملية التوليف وتقييد لمتواليات قصيرة بدلا تعيق تطبيق هذه المنهجية. من ناحية أخرى، يتم تنشيط triphosphates نوكليوزيد تعديل اللبنات التي استخدمت لإدخال خفيف من العديد من المجموعات الوظيفية في الأحماض النووية، وهي الاستراتيجية التي تمهد الطريق لاستخدام الأحماض النووية التي تم تعديلها في لوحة واسعة النطاق من التطبيقات العملية مثل علامات الوظيفية وجيل من الريبوزيمات وDNAzymes. واحدة من التحديات الرئيسية تكمن في تعقيد منهجية تؤدي إلى العزلة وتوصيف هذه نظائرها نوكليوزيد.
في هذه المقالة الفيديو، نقدم بروتوكول مفصلة لتركيب تساه تعديل نظائرها باستخدام الفوسفور الكواشف (III) مقرا لها. بالإضافة إلى ذلك، ويكشف الإجراء لتوصيف بهم الكيمياء الحيوية، مع التركيز بشكل خاص على التمهيدي ردود الفعل الإرشاد وTDT المخلفات البلمرة. وهذا البروتوكول تفصيلا أن تكون ذات فائدة للصياغة من dNTPs تعديل وزيادة استخدامها في البيولوجيا الكيميائية.
Introduction
triphosphates 5'-نوكليوزيد ((د) من هذه البرامج الوطنية) تمثل فئة من الجزيئات الحيوية الحيوية التي تشارك في عمليات ومهام لا تعد ولا تحصى بدءا من كونه العملة العالمية من الطاقة لالمنظمين في استقلاب الخلية. بالإضافة إلى دورها في هذه التحولات البيولوجية الأساسية، تقدمت نظرائهم تعديل كمنصة تنوعا ومعتدل لإدخال مجموعات وظيفية في أليغنوكليوتيد]، وهي المنهجية التي تكمل بشكل جيد توليف المرحلة الصلبة الآلي التي عادة ما يتم تطبيقها 1،2. في الواقع، يمكن أن تقدم (د) من هذه البرامج الوطنية بمثابة ركائز لRNA والحمض النووي بلمرة 3، وثروة من المجموعات الوظيفية بما في ذلك الأحماض الأمينية 4-13، والأحماض boronic 14،15، 16 nornbornene، مثل بقايا الألماسية-17، جنبا إلى سلاسل ل organocatalysis 18، 19 الأحماض الصفراوية، وحتى أليغنوكليوتيد] 20 يمكن إدخالها أليغنوكليوتيد].
_content "> ما وراء تمثل ناقلات مريحة للfunctionalization من الأحماض النووية، dNTPs تعديل يمكن أن تشارك في سيليكس وأساليب اندماجي الأخرى ذات الصلة في المختبر اختيار لتوليد تعديل الأحماض النووية الحفاز 21-30 والأبتامرات للتطبيقات العملية المختلفة 10، 31-36. ويعتقد أن الجانب سلاسل الإضافية التي يتم تقديمها من قبل البلمرة من dNTPs تعديل لزيادة المساحة الكيميائية التي يمكن استكشافها خلال تجربة الاختيار واستكمال الترسانة وظيفية الفقراء بدلا من الأحماض النووية 37. ومع ذلك، على الرغم من هذه الصفات الجذابة والتقدم المحرز مؤخرا في تطوير كل الاصطناعية والأساليب التحليلية، لا يمكن تطبيقها عالميا والإجراءات ذات العائد المرتفع موجود لصياغة من triphosphates نوكليوزيد تعديل 2،38.الهدف من هذا البروتوكول هو لتسليط الضوء في (في بعض الأحيان) إجراءات معقدة الرائدة رس توليف وتوصيف البيوكيميائية من هذه اللبنات المنشط (الشكل 1B). وسيتم التركيز بشكل خاص على كل التفاصيل الاصطناعية التي غالبا ما يصعب العثور على أو غائبة في أقسام تجريبية ولكن لا يزال حاسما لإنجاز الناجح لمسار الاصطناعية مما أدى إلى عزلة نقية (د) من هذه البرامج الوطنية (الشكل 1).
Protocol
1. تجميع للنوكليوزيد Triphosphates معدلة النهج الاصطناعية اختار يتبع الإجراء التي وضعتها لودفيغ واكشتاين لأن هذا الأسلوب هو موثوق بها عموما ويؤدي إلى عدد قليل جدا من المنتجات الجانبية (الشكل 1A) 39. <ol style=";text-align:right;direction:rtl…
Representative Results
triphosphates نوكليوزيد تعديل ومغرية الأهداف الاصطناعية لأنها تسمح لإدخال السهل من مجموعة واسعة من المجموعات الوظيفية في الأحماض النووية 41. ومع ذلك، غالبا ما يتم الكشف عن العزلة وتوصيف هذه اللبنات تفعيلها لتكون شاقة. وبالتالي، يعتقد أن النتائج أظهرت هنا لتقديم يد ا?…
Discussion
إدراج التعديلات في الأحماض النووية هو من مصلحة للعديد من التطبيقات العملية بما في ذلك تطوير العقاقير وكلاء antigene 42،43، ووضع العلامات الجغرافية والوظيفية للأليغنوكليوتيد] 41، والجهود الرامية إلى توسيع الأبجدية الجينية 44-46. عادة يتم إدخال التعديلات ال…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (المنح رقم PZ00P2_126430 / 1 وPZ00P2_144595). ومن المسلم البروفيسور جيم Leumann بامتنان لتوفير مساحة ومعدات المختبرات، فضلا عن دعمه المستمر. ومن المسلم به السيدة سو KNECHT لإجراء مناقشات مثمرة.
Materials
| tributylammonium pyrophosphate | Sigma Aldrich | P8533 | Hygroscopic solid, keep under Ar |
| 2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one | Sigma Aldrich | 324124 | Moisture sensitive |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 82704 | Under molecular sieves |
| Dioxane | Sigma Aldrich | 296309 | Under molecular sieves |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 40248 | Under molecular sieves |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90342 | |
| Tributylamine | Sigma Aldrich | 90781 | |
| ddH2O | Milli-Q | deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC) | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | 159220 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-25 | |
| Biochemical reagents | |||
| g-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| Natural dNTPs | Promega | U1420 | |
| Vent (exo–) DNA polymerase | NEB | M0257S | |
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | MO210S | |
| 9°Nm DNA polymerase | NEB | MO260S | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA polymerase | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarose | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Equipment | |||
| Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| PCR vials | Bioconcept | 3220-00 | |
| HPLC system | Amersham Pharmacia Biotech | Äkta basic 10/100 | |
| Oligonucleotides | |||
| All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1 | |||
| 5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1 | |||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles: | |||
| Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330 | |||
| Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F. |
Referenzen
- Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
- Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates – Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
- Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2′-Modified Ribonucleoside 5′-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
- Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2′-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
- Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
- Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
- Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
- Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
- Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
- Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
- Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
- Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
- Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
- Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
- Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
- Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
- Biomol Chem, O. r. g. . 9, 7482-7490 (2011).
- Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
- Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
- Baccaro, A., Steck, A. -. L., Marx, A. . Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
- Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
- Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
- Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
- Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
- Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
- Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
- Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
- Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
- Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2′-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
- Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
- Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
- Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
- Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
- Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
- Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
- Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5′-0-(1-thiotriphosphates), 5′-triphosphates and 2′,3′-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
- Williams, D. M., Harris, V. H., Murphy, J. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. 9, 237-275 .
- Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
- Kurreck, J. Antisense technologies – Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
- Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
- Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
- Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
- Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
- Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
- Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
- Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
- Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
- Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3′-end protection using 2′,4′-bridged nucleoside-5′-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
- Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
- Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).
Diesen Artikel zitieren
Hollenstein, M., Smith, C. C., Räz, M. Nucleoside Triphosphates – From Synthesis to Biochemical Characterization. J. Vis. Exp. (86), e51385, doi:10.3791/51385 (2014).