التصوير مسح النظم البيولوجية السليمة على المستوى الخلوي عن طريق 3DISCO
Summary
To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.
Abstract
Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.
Introduction
الفحص النسيجي من الأنسجة البيولوجية هو نهج أساسي في فهم طبيعة الجزيئات / الخلايا في سياقها الطبيعي. من الناحية المثالية، التصوير ذات الدقة العالية للجهاز بأكمله هو أكبر قدر من المعلومات والمطلوب. لأن الضوء لديه عمق الاختراق محدودة، وذلك بسبب تناثر 1، الأجهزة الثابتة يجب أن تكون مقطوع من أجل أداء عالية الدقة التصوير المجهري. وبالتالي، فإن معظم الدراسات التي أجريت على الأنسجة وقليل من أقسام الأنسجة تمثل سوى جزء صغير من الجهاز. في بعض الدراسات، على سبيل المثال، تلك التي تهدف إلى تعقب من الوصلات العصبية في الدماغ أو الحبل الشوكي، يتم جمع جميع أقسام الأنسجة من الأعضاء المستهدفة وتصويرها لإعادة الإعمار 3D. ومع ذلك، باجتزاء الأنسجة والتصوير لاحقة من المقاطع الفردية والقيود المختلفة. وتشمل هذه كونها مضيعة للوقت ويؤدي إلى إعادة الإعمار 3D غير مكتملة من الأنسجة، وذلك بسبب التشوهات الميكانيكية وصعبةالمنشأ في محاذاة الصور الناتجة.
في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير أجهزة التصوير المقاصة وشفافة سليمة كحل كبيرة لهذا القصور 2،3. على تبادل المعلومات، يتم تقديم الجهاز بأكمله شفافة تسمح للضوء التصوير في السفر نهاية إلى نهاية (الشكل 1) لإنتاج صور عالية الدقة من الجهاز unsectioned باستخدام مجهر المسح الضوئي ليزر مثل الفوتون أو ورقة خفيفة متعددة المجهر ( الشكل 2). وقد وضعت مجموعات بحثية مختلفة بروتوكولات تبادل المعلومات أنسجة جديدة لتكون قادرة على الصورة أنسجتهم من الفائدة لأغراض مختلفة. وتشمل هذه المذيبات العضوية 2-5، 6،7 المياه ومقرها الكهربائي 8 بروتوكولات تبادل المعلومات. فيما بينها، والتصوير 3 الأبعاد للمسح المذيبات أو أجهزة 3DISCO هو بروتوكول للتطبيق بسهولة على مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية بما في ذلك الجهاز العصبي المركزي (CNS) أجهزة وأجهزة المناعة والأورام الصلبة. في additأيون، فإنه يمكن الجمع بين تقنيات الفحص المجهري مختلفة مثل المجهر الضوئي ورقة مضان (LSFM)، متعددة الفوتون ومتحد البؤر المسح الضوئي ليزر المجهري. ويستند 3DISCO تنقية مع الكواشف متوفرة وغير مكلفة مثل رباعي هيدرو الفوران (THF) والأثير dibenzyl (DBE) 4. بروتوكول كامل يمكن أن يستغرق قصيرة قدر 3-4 ساعة. وبالتالي، 3DISCO هي تقنية قوية وسريعة بالمقارنة مع الطرق التقليدية النسيجية التي قد تستغرق أسابيع أو شهور لإكمال 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
تهدف أساليب المقاصة الأنسجة للحد من تشتت الضوء التصوير عن طريق مطابقة معاملات الانكسار من طبقات الأنسجة المختلفة في أجهزة مسح. ونتيجة لذلك، لا يمكن للضوء التصوير التوغل عميقا في الأنسجة وتحفيز الخلايا المسمى / الجزيئات. وقد اكتسب هذا المفهوم القديم للأنسجة تطهير 17 الاهتمام المتزايد بعد أول تطبيق لهذه التقنية المتطورة على أدمغة فئران سليمة من قبل Dodt والزملاء 2. منذ ذلك الحين، هناك قائمة متزايدة بسرعة أساليب جديدة بما في ذلك تبادل المعلومات 3DISCO، هيئة السلع التموينية / ه، ClearT2 والوضوح وSeeDB 3،4،7،18-20. في جوهرها، وأنهم جميعا تهدف إلى جعل أجهزة شفافة للتصوير الأنسجة العميقة من خلال الحفاظ على التسمية الفلورسنت. من بينها، 3DISCO تبرز باعتبارها واحدة من الطرق الأكثر مباشرة وقابلة للتكرار. فهو سريع نسبيا بالمقارنة مع الطرق الأخرى المذكورة أعلاه المقاصة (1-5 أيام مقابل 2-3 أسابيع لأدمغة البالغين، على التوالي) 21. وقد تم بالفعل النجاحيطبق بالكامل إلى الأجهزة المختلفة مثل المخ والحبل الشوكي، والعقد اللمفاوية والطحال والرئة، والأورام الصلبة، والبنكرياس، والغدد الثديية 3،4،9. بالإضافة إلى ذلك، العديد من المنشورات من قبل مجموعات بحثية مستقلة استخدمت بالفعل هذه الطريقة للحصول على النتائج التصوير 22،23. ومع ذلك، يمكن أن تختلف إجراءات المقاصة الأنسجة يكون من المفيد لظروف مختلفة. على سبيل المثال، في حين أن هيئة السلع التموينية / ه وSeeDB قابلة للتطبيق أفضل على الأنسجة الجنينية 6،7، فهي طرق تبادل المعلومات تعتمد على الماء، والتي يمكن أن يكون أسهل في التعامل معها أثناء التصوير. في المقابل، والوضوح هو أسلوب المقاصة معقدة ومكلفة. ولكن يمكن أن يكون من المفيد في سياق وضع العلامات الضد، وخاصة في الأنسجة الكبيرة مثل الدماغ 8.
الخطوة الأكثر أهمية للحصول على أفضل النتائج من التصوير 3DISCO هو وضع العلامات الأنسجة، والذي تحقق قبل المقاصة الأنسجة. فمن الضروري أن تبدأ مع أقوى إشارة الفلورسنت ممكن. هذا يمكن به تحقيقها بطرق مختلفة بما في ذلك التعبير المعدلة وراثيا من البروتينات الفلورية والبحث عن المفقودين من قبل الأصباغ الاصطناعية، ترنسفكأيشن الفيروسية أو وضع العلامات الأجسام المضادة. ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن أي إجراء المقاصة سوف يقلل من إشارة الفلورسنت من الأنسجة. وبالتالي، إذا كانت إشارة الفلورسنت ليست قوية بما فيه الكفاية في بداية – أي أنه لا يمكن كشفها بسهولة أمام المقاصة التصوير من الأنسجة مسح سيلقي النتائج السيئة.
هناك بعض القيود المفروضة على تطهير الطرق التي تنتظر التحسينات. وجود قيود أهمية هو أنه منذ الكواشف تطهير تغيير هيكل أجهزة مسح، فإنها لا يمكن أن تستخدم على الأنسجة الحية. وبالتالي، والتجارب مع مثل mEos2 photoactivatable 24 يجب أن يتم تنفيذ قبل تحديد والمقاصة. على المقاصة، فائقة التصوير القرار من إشارة الفلورسنت من البروتينات مشرق وصامد يصبح ذلك ممكنا. بالإضافة إلى ذلك، لأن البروتوكول المقاصة يقلل منكثافة البروتينات الفلورية وأجهزة مسح لا يمكن تخزينها لفترات طويلة. من المهم أن نلاحظ أن بعض الأجهزة من الصعب أن يتم مسح. خصوصا، إذا كانت أجهزة تشريح الاحتفاظ كميات عالية من خلايا الدم (على سبيل المثال، الطحال، الكبد)، فهي صعبة نسبيا لمسح والصورة. بل هو أيضا أكثر صعوبة نسبيا لتحقيق المقاصة كاملة للأنسجة كبيرة، مثل القوارض الكبار الدماغ. مثل هذه الأنسجة قد تحتاج مرات الحضانة لفترة أطول، والتي يمكن، من ناحية أخرى، والحد من إشارة الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك، تطوير أساليب الفحص المجهري يمكن أن صورة أجهزة شفافة كبيرة في آن واحد بدرجة وضوح عالية هو ضرورة انتظار لمعالجتها. آخر قيود هامة لهذه التقنية هي وضع العلامات الأنسجة. في حين أن إشارة قوية الفلورسنت عبر التعبير الجيني أو فيروس مثالية، وليس كل خلية أو جزيء يمكن أن توصف وراثيا أو فيروسي. من ناحية أخرى، ووضع العلامات الضد من الأنسجة سميكة ليس إجراءات واضحة أو حتى لا بوssible في معظم الحالات. قد تحتاج إلى بروتوكولات permeabilization الخاصة ومرات حضانة طويلة (عدة أيام إلى بضعة أسابيع) 3. من المهم أيضا أن نأخذ في الاعتبار أن الأنسجة يتقلص ~ 20٪ في كل البعد (قياس للأنسجة الحبل الشوكي) بعد تطهير ويرجع ذلك أساسا إلى الجفاف وإزالة الشحميات. يحدث هذا الانكماش ratiometrically وينبغي تصحيحه في الخطوات الكمي. كما لوحظ في النتائج المقدمة، لا تزال هياكل fluorescently المسمى سليمة، وهو مؤشر على سلامة البروتين في أنسجة تطهيرها. بسبب طبيعة مسعور من الأنسجة تطهيرها النهائي، فإنه لا يمكن زيادة ملطخة الأجسام المضادة أو جزءا لا يتجزأ من الحلول التي تحتوي على الماء على سبيل المثال، Focusclear-والذي يستخدم في وضوح أو 80٪ الجلسرين. أخيرا، فإنه يشكل تحديا لتحليل أحجام الساحقة من بيانات التصوير. على سبيل المثال، عندما يتم فحص دماغ الفئران كامل في قرار الخلوية، فإنه سيكون من الصعب جدا تتبع وقياس شارع المطلوبuctures (على سبيل المثال، أو الشبكات العصبية الدبقية) وقارن بين أكثر من عينات مختلفة بطريقة آلية. باختصار، في حين تهدف الباحثين لمعرفة أساليب جديدة المقاصة، ينبغي تحسين مختلف التحديات أعلاه (صعوبة تطهير الأنسجة المختلفة، والتصوير بدقة عالية من مناطق أوسع، وتحليل البيانات المعقدة) في نفس الوقت.
في الختام، الأنسجة وضعت مؤخرا تقنيات المعلومات بما في ذلك 3DISCO، تثبت أن بأناقة التصوير ذات الدقة العالية 3D الأجهزة سليمة هو ممكن الآن. باستخدام هذه الطرق، يمكن للعلماء الحصول على معلومات تشريحية من الخلايا والجزيئات في الجهاز سليمة. هذه الدراسات التصوير 3D الرائدة على أجهزة شفافة مصدر إلهام لعدد متزايد من الباحثين فك التشريحية المعقدة والمنظمات الجزيئي للأنسجة / أجهزة في هيث والمرض.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر C. Hojer لقراءة نقدية للمخطوطة، B. بينغول (جينينتيك) للمشاركة في السرد النصي، N. بيان، لي لتقاسم تجربة محسنة التصوير الأوعية الدموية مع حقن الوريد الذيل من كتين صباغة، وM Solloway (جينينتيك ) لالفئران المستخدمة في التصوير البنكرياس. تم إنشاء خط GFP-M من قبل J. سانس (جامعة واشنطن في سانت لويس) والفئران CX3CR1-GFP بواسطة R. يتمان (جامعة نيويورك). ويدعم هذا العمل من قبل جينينتيك، وشركة
Materials
| Thy-1 GFP (GFP-M) mouse | can be obtained from Jackson | ||
| CX3CR1 GFP mouse | can be obtained from Littman lab at NYU | ||
| TgN(hGFAP-ECFP) mouse | can be obtained from Jackson | ||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7917-16 | |
| NaH2PO4 | (Mallinckrodt, 7892-04) | ||
| 2-2-2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 152463 | used to prepare Avertin solution |
| Saline | Braun | ||
| Tetrahydrofuran | Sigma | 186562-12X100ML | |
| Dichloromethane | Sigma | 270997-12X100ML | |
| Dibenzyl ether | Sigma | Sigma, 108014-1KG | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 305197-100ML | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | |
| Lectin FITC | Sigma | L0401-1MG | |
| anti-CC10 | Santa Cruz | SC-9772 | 0.388888889 |
| Heparin | APP pharmaceuticals | 504001 | used in perfusion |
| Glass vials | VWR | 548-0554 | |
| Forceps | FST | 11251-10 | |
| Mini Rotator | VWR | 100498-878 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 01-213-104 | |
| 100mL Media Storage Bottles | Kimax Media Bottles | EW-34523-00 | |
| Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head | Gilson, Inc | F110701 and F117606 | |
| Microscopy slide | VWR | 48311-703 | |
| FastWell | Grace Bio-Labs | FW20 | |
| Cover slip | Corning | 2940-245 | |
| Glass petri dish | Corning Pyrex | 3160-101 | |
| Dental cement | Lang Dental | 1223PNK | |
| Quantofix Peroxide Test Strips | Sigma | 37206 | |
| Amira with RT resolve microscopy module |
Visage Imaging | image analysis software | |
| Imaris | Bitplane imaging | image analysis software | |
| ImageJ | NIH | freeware |
Referenzen
- Tuchin, V. . Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. , (2007).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18, 166-171 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Erturk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome. Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).
- Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy. Cornea. 25, 497-498 (2006).
- Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).
- Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. Microglia in neurodegenerative disease. Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).
- Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice. Neurology. 2, 679-689 (2006).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten. , (1903).
- Smith, C., et al. The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury. Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).
- Zotova, E., et al. Microglial alterations in human Alzheimer’s disease following Abeta42 immunization. Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).
- Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. Bilateral cochlear implantation in Friedreich’s ataxia: A case study. Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).
- Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).
- Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
- Soderblom, C., et al. Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury. J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6, 131-133 (2009).
