से electrophysiological रिकॉर्डिंग<em> ड्रोसोफिला</em> Labellar Sensilla स्वाद
Summary
इस प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला में labellar स्वाद न्यूरॉन्स द्वारा चलाई कार्रवाई संभावित प्रतिक्रिया के कोशिकी रिकॉर्डिंग का वर्णन करता है.
Abstract
कीड़ों की परिधीय स्वाद प्रतिक्रिया शक्तिशाली electrophysiological तकनीकों के साथ जांच की जा सकती है. यहाँ वर्णित विधि शोधकर्ता कीट तंत्रिका तंत्र अपने वातावरण में स्वाद उत्तेजनाओं से मिलने वाले संवेदी इनपुट को दर्शाती है, सीधे और मात्रात्मक स्वाद प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल इस तकनीक के प्रदर्शन में सभी महत्वपूर्ण कदम की रूपरेखा. इस तरह के आवश्यक उपकरण और रिकॉर्डिंग के लिए एक उपयुक्त वातावरण के चयन के रूप में एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग, संयोजन में महत्वपूर्ण कदम, चित्रित कर रहे हैं. हम भी उपयुक्त संदर्भ और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड बनाकर रिकॉर्डिंग के लिए तैयार करने के लिए कैसे का वर्णन है, और tastant समाधान. हम विस्तार में सूंड स्थिर करने के क्रम में मक्खी में एक गिलास संदर्भ इलेक्ट्रोड की प्रविष्टि द्वारा कीट तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता विधि का वर्णन. हम एक चीनी और एक कड़वा परिसर के जवाब में स्वाद न्यूरॉन्स द्वारा चलाई बिजली के उद्यमी के निशान दिखाते हैं. प्रोटोकॉल के पहलुओं टी रहे हैंechnically चुनौती है और हम इस तरह के संकेत या प्रणाली में अत्यधिक शोर की कमी है, और संभावित समाधान के रूप में सामना किया जा सकता है कि कुछ आम तकनीकी चुनौतियों का एक व्यापक विवरण शामिल हैं. तकनीक ऐसी है, अस्थायी परिसर उत्तेजनाओं देने प्रसव प्रोत्साहन के लिए तुरंत पहले फायरिंग पृष्ठभूमि निरीक्षण, या सुविधापूर्वक जल अघुलनशील स्वाद यौगिकों का उपयोग करने में असमर्थता के रूप में सीमाओं की है. इन सीमाओं के बावजूद, (प्रोटोकॉल में संदर्भित मामूली बदलाव भी शामिल है) इस तकनीक, यौगिकों स्वाद के लिए ड्रोसोफिला neuronal प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग के लिए मोटे तौर पर स्वीकार किए जाते हैं प्रक्रिया एक मानक है.
Introduction
स्वाद की भावना एक कीट घुलनशील रसायनों का एक विशाल रेंज का पता लगाने के लिए अनुमति देता है और एक पौष्टिक पदार्थ की स्वीकृति में एक महत्वपूर्ण भूमिका है, या एक हानिकारक या जहरीले एक की अस्वीकृति निभाता है. स्वाद भी फेरोमोन 1-5 का पता लगाने के माध्यम से, दोस्त चयन में एक भूमिका निभा सोचा है. इन महत्वपूर्ण और विविध कार्यों संवेदी प्रणाली पर्यावरण cues प्रासंगिक व्यवहार outputs में अनुवाद कैसे में कीट स्वाद प्रणाली जांच की एक सम्मोहक लक्ष्य बनाया है.
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर स्वाद प्रणाली की प्राथमिक इकाई स्वाद बाल, या Sensillum है. अणु इसकी टिप 2,6 पर एक ताकना के माध्यम से Sensillum दर्ज करें. Sensilla labellum, पैर, पंख मार्जिन, और ग्रसनी 6 पर पाए जाते हैं. Labellum पर, sensilla की संख्या और स्थान टकसाली है. लंबी (एल), मध्यवर्ती (आई), और छोटी (एस: तीन रूपात्मक लंबाई के आधार पर sensilla के वर्गों रहे हैं ) 7,8 sensilla. प्रत्येक Sensillum दो (मैं प्रकार) या चार (एल और एस प्रकार) स्वाद रिसेप्टर न्यूरॉन्स (GRNs) 9 या तो होता है. विभिन्न GRNs स्वाद उत्तेजनाओं की विभिन्न श्रेणियों का जवाब: कड़वा, चीनी, नमक और परासारिता 7,10 और स्वाद रिसेप्टर्स 8,11-13 के विभिन्न सबसेट व्यक्त करते हैं. केवल मैं और एस प्रकार sensilla कड़वा उत्तरदायी GRNs 8,10 होते हैं. Subesophageal नाड़ीग्रन्थि (एसओजी) और स्वाद अणुओं से उनके सक्रियण को GRNs परियोजना एक व्यवहार प्रतिक्रिया 6, जिसके परिणामस्वरूप डिकोडिंग के लिए उच्च केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए रिले की जाती है. न्यूरॉन्स की संख्या अपेक्षाकृत छोटे और आणविक और व्यवहार विश्लेषण करने ज़िम्मा ड्रोसोफिला स्वाद प्रणाली सामान्य रूप में स्वाद प्रणालियों की जांच के लिए एक शानदार मॉडल बना. प्रणाली आनुवंशिक उत्परिवर्तन या GAL4-यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली के माध्यम से हेरफेर किया जा सकता है जिसके साथ रिश्तेदार आसानी भी एक महत्वपूर्ण उपकरण 14,15 के रूप में कार्य करता है.
इन sensilla labellum की सतह से बहर "क्योंकि ontent>, वे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए उत्कृष्ट लक्ष्य बनाते हैं. GRNs की फायरिंग कोशिकी रिकॉर्डिंग उपयोग पर नजर रखी जा सकती है. ऐतिहासिक, में डाला कांच इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है जो बगल की दीवार रिकॉर्डिंग विधि, Sensillum neuronal गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए, 26 इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, इस विधि को करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौती दे रहा है, और यह लंबे समय से प्रत्येक तैयारी से के लिए रिकॉर्ड करने के लिए मुश्किल है. एक इलेक्ट्रोड के साथ न्यूरॉन्स की प्रतिक्रिया जो उपाय टिप रिकॉर्डिंग विधि, कि एक साथ एक tastant बचाता है, क्योंकि चुनाव 9,16 का तरीका बन गया है. यह ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर 8,10,17,18 का स्वाद प्रणाली के साथ ही अन्य कीट प्रजातियों 19-23 की संख्या की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है. यह है बहुत लिए compensating द्वारा टिप रिकॉर्डिंग विधि के प्रमुख कमियां में से एक overcame जो tastePROBE एम्पलीफायर का विकास, द्वारा सुविधा किया गयाGRN कार्रवाई क्षमता अत्यधिक प्रवर्धन या फ़िल्टरिंग 24 बिना दर्ज करने की अनुमति संदर्भ इलेक्ट्रोड और कीट Sensillum के बीच बड़े संभावित अंतर,. एक अन्य महत्वपूर्ण विकास रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोलाइट के रूप में 25 tricholine साइट्रेट का उपयोग किया गया था. टीसीसी परासारिता संवेदनशील GRN से प्रतिक्रियाओं को दबा है और 25 का विश्लेषण करने के लिए बहुत आसान कड़वा और चीनी tastants द्वारा उत्पन्न प्रतिक्रियाओं बनाने, नमक के प्रति संवेदनशील GRN को प्रोत्साहित नहीं करता है.यहाँ हम ड्रोसोफिला labellar sensilla की नोक रिकॉर्डिंग वर्तमान में कार्लसन प्रयोगशाला में किया जाता है वर्णन कैसे. इस प्रोटोकॉल एक उपयुक्त इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी कैसे उड़ान भरने को तैयार करने के लिए रिग,, और कैसे स्वाद रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए स्थापित करने के लिए समझाना होगा. इस का उपयोग करते समय हम भी ड्रोसोफिला sensilla के सबसेट है, साथ ही कुछ आम समस्याएं और सामना हो सकता है कि संभावित समाधानों से रिकॉर्डिंग से प्राप्त की कुछ प्रतिनिधि डेटा पेशतकनीक.
Protocol
Representative Results
Discussion
Labellar sensilla कारण आकारिकी और संरचनात्मक संगठन में मतभेद की रिकॉर्डिंग के आराम में भिन्नता है. कभी कभी एक Sensillum, किसी भी tastants के लिए एक सकारात्मक प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने के लिए जाना जाता है कि एक भी जवाब ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम (आरडी) के लिए एक एनआरएसए predoctoral अनुदान 1F31DC012985 द्वारा और जे.सी. लिए एनआईएच अनुदान द्वारा समर्थित किया गया
हम मदद के संकलन के आंकड़े के लिए पांडुलिपि, डॉ. रयान यूसुफ पर सहायक टिप्पणियों के लिए डॉ. Linnea वेइस का शुक्रिया अदा करना, और सहायक तकनीकी सलाह के लिए डॉ. फ्रेडरिक मैरियन चुनाव होगा. हम भी चार समीक्षकों की उपयोगी टिप्पणी को स्वीकार करना होगा.
Materials
| Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150x magnification with long working distance table mount stand |
| Anti-vibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5ml serological pipette for extended range |
| Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5mm diameter |
| Retort Stand | generic | ||
| Outlet Plastic Tube | generic, 1cm diameter | ||
| Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
| 500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
| Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
| Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
| Insulated Electrical Wire | Generic | ||
| Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use Labview with NI-6251 |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electro-magnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
| Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
| Stereo Microscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10x-40x magnification |
| Ice Bucket | Generic | ||
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
| 1ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
| 10ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |
Referenzen
- Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science (New York, N.Y.). 287, 1830-1834 (2000).
- Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
- Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of “bitter” taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
- Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
- Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
- Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
- Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. a. n. Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
- Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
- Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
- Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
- Axon Instruments. . The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
- Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
- Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).
