חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

הפרעות נפשיות ונוירולוגיות מייצגות 13% מהנטל העולמי של מחלה, אתגרים חדשים כמו מנגנונים pathophysiological, גורמי סיכון וסמנים ביולוגיים prodromal חייבים להיחקר ^1. בקנה אחד עם מטרה זו, מחקרי פרוטאומיקה של המוח האנושי הפכו הכרחיים כדי לחשוף את המסלולים מולקולריים מעורבים בתהליכים כמו זיכרון, התנהגות, רגשות ופלסטיות עצבית למשל, לא רק לפיסיולוגי, אלא גם למצבים פתולוגיים. לכן, השימוש במודלים של בעלי חיים ובאופן ספציפי יותר עכברים הטרנסגניים, מביא מגוון רחב של אפשרויות על מנת לחקות את אטיולוגיה של מחלות המוח ניווניות ^2.

פרוטאומיקה גישות זמינות כיום על מנת להשיג את נקודות המבט חדשים בתחום מדעי המוח. אלקטרופורזה דו ממדי ג'ל (2DE) היא שיטה פשוטה ורבה עוצמה סבירה, המאפשרת להשוות את proteome של מגוון רחב של דוגמאות. יתר על כן, הוא גםשיטה רבת עוצמה לבודד את חלבון מתערובת מורכבת על מנת לזהות ולנתח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה. טכניקה זו בעצם מורכבת בשני שלבים רצופים: 1) הפרדת חלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית (PI) על ידי isoelectrofocusing (IEF). לייתר דיוק, פוטנציאל חשמלי מוחל על פני רצועות acrylamide immobiline בין שיפוע pH ולאחר מכן החלבונים יעברו ולהתמקד בפיי נחוש בפונקציה של מטען נטו הגלובלי שלהם. 2) חלבוני Isoelectrically ממוקדים הם מפוגלים ומטען שלילי על ידי התוספת של נתרן גופרתי dodecyl (SDS), ובכך חלבונים במבנה הראשון שלהם מופרדים בהתאם למשקל המולקולרי לכאורה שלהם (MW) על ידי-SDS ^3. שני מאפיינים ייחודיים אלה מאפשרים לנו להתמודד עם ערך כפול ללכת רחוק יותר במחקר של proteome. מצד אחד גישה זו מציעה את האפשרות לבצע ניתוח כמוני באמצעות צבעים מינימאליים שיטת 2D-DIGE, ומצד שני qualitativניתוח דואר על ידי מיני 2DE מצמידים מערבי סופג.

ניתוח כמותי של 2D-DIGE מעניק ביטוי חלבון משתנה בכל רחבי proteome המדגם. בקצרה, דגימות מסומנות עם שלוש cyanines (Cy2, Cy3 וCy5) פולטת בשלושה אורכי גל שונים (כחול, ירוק ואדום). צבעים מינימאליים פלואוריד אלה המכילים קבוצת succinimidyl אסתר N-הידרוקסי מגיבים עם קבוצת ε-אמינו של שאריות lysines של חלבונים וכתוצאה מכך אגרות חוב אמיד קוולנטיים ^4. שאריות ליזין מסומנות רק בין 1-3% ובכך מונע בנוסף תוויות מרובות לכל חלבון ושינויים גדולים תשלום נטו ^{5, 6.} Cy3 וCy5 משמשים לעתים קרובות כדי לתייג את שני מדגמים בלתי תלויים ואילו Cy2 תגי תמהיל שלהן משקל שווה בדגימות כדי להשוות. שני היתרונות העיקריים הם כי כל הדגימות שכותרתו הן מעורבות וIEF ו- SDS מתבצעים בג'ל אחד בפעם אחת לכל שלב, תוך הימנעות מהשתנות היתר בקרב ניסויים בשל ג'לי השוואה. יתר על כן, הוא מציג סף זיהוי גבוה של כ 1 femtomole של חלבון ^7. ג'לים נסרקים ותוכנת 2D משווה את תמונות 2D ג'ל הקרינה, שבו Cy2 משמשת כתקן המאפשר זיהוי של הבדלים סטטיסטיים בין הכתמים לזיהוי האחורי שלהם על ידי ספקטרומטריית מסה פנימי. תוכנת ניתוח 2D באמצעות התקן הפנימי משיגה זיהוי מהיר של פחות מ -10% מהבדלים בין דגימות עם יותר מ 95% של ביטחון סטטיסטי ^8.

ניתוח איכותני על ידי מיני 2DE הוא צעד חיוני לאפיון חלבונים. העיקרון הוא אותו כפי שתואר לעיל עבור PI והפרדת MW, אבל במקרה הזה חלבונים מועברים מג'ל polyacrylamide קטן קרום וimmunoblotting מתבצע לאחר מכן. בעוד ג'ל אלקטרופורזה ממד אחד מספקת שינויים בביטוי חלבונים לאחד או כמה אפיטופים חלבון בתפקוד של הנוגדן, information של מיני 2DE מעניק עם שני פרמטרים נוספים. ראשית, isovariants חלבון השינוי בתפקוד של פיי, המצביע על כך שלאחר translational שינויים עשויים להתרחש. שנית, זיהוי ספקטרומטריית מסה עשויה להצביע על zymogens הסביר ומוצרים קטבולי של חלבונים. לכן, שינויים שנצפו על ידי 2D-DIGE צפויים מעיד על המנגנונים העומדים בבסיס שינויים בפרופיל proteome הגלובלי. מערכים של immunoblots בין כמה דוגמאות מאותה epitope החלבון / s על ידי מיני 2DE עשויים לשקף שינויי חומציות לשפוך אור לתוך וריאציות לאחר translational מעט נצפו או אפילו לא על ידי immunoblotting monodimensional ^{9, 10.} יתר על כן, ניתוח זה מודיע על אתרי מחשוף הפוטנציאליים בשל הידע של הצרכן וMW של השאריות מטבולי ^11,12.

השילוב של שתי טכניקות אלה מספק ניתוח פרוטאומיקה משלים. מצד אחד 2D-DIGE מקנה typדואר של הבדלים המאפשרים בידוד מדויק של פוליפפטידים הביטוי שלו הוא שונה. הבדלים אלה כוללים למעשה להופעה או ההיעלמות של נקודה או עלייה / ירידה של עוצמת נתון אחד על ידי ניתוח תוכנה של ג'לי הניאון. עם זאת, התצפיות הללו על ידי עצמם הן סבירה כדי להסביר את טיבו של השינוי שנצפה. מסיבות אלה, ברגע שפוליפפטיד בודד וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה, השימוש במיני 2DE מאפשר לאשר 1 בדיוק) את זהותו של החלבון מבודד ו2) טבעו של ההבדל: השינוי ברמת isovariant / איזופורם של ביטוי, שלאחר translational שינויים ותהליכי מחשוף למשל. עם זאת, יש צורך לפתח את מאגר תמוגה מתחיל שניהם בקנה אחד עם 2D-DIGE ועם מיני 2DE על מנת להגביל תפוצות הפוטנציאליות הנובעות מהשימוש בפרוטוקולי חילוץ כי הם מאוד שונים.

במאמר הנוכחי, אנחנו דהשתואר בפרוטוקול מותאם להכנה, החילוץ וביצועים של 2D-DIGE וטכניקות מיני 2DE לחלבונים במוח מגיעים מהרקמה אנושית ועכבר.