Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

Psychische en neurologische aandoeningen vertegenwoordigen 13% van de wereldwijde ziektelast, moet nieuwe uitdagingen zoals pathofysiologische mechanismen, risicofactoren en prodromale biomarkers worden onderzocht ^1. In lijn met deze doelstelling, proteomics studies van het menselijk brein onmisbaar geworden moleculaire pathways betrokken bij processen zoals geheugen, gedrag, emoties en neuronale plasticiteit bijvoorbeeld, niet alleen voor de fysiologische, maar ook voor pathologische omstandigheden duidelijk worden. Daarom is het gebruik van diermodellen en meer specifiek de transgene muizen, brengt een groot aantal mogelijkheden om de etiologie van humane neurodegeneratieve aandoeningen ² nabootsen.

Proteomics benaderingen zijn tegenwoordig beschikbaar om deze nieuwe perspectieven te bereiken op het gebied neurowetenschappen. Tweedimensionale gelelektroforese (2DE) is een krachtige en waarschijnlijke eenvoudige methode waarmee vergelijken het proteoom van een groot aantal monsters. Bovendien is ook eenkrachtige methode om een ​​isolaat uit een complex mengsel te identificeren en verder geanalyseerd door massaspectrometrie. Deze techniek bestaat in hoofdzaak in twee opeenvolgende stappen: 1) eiwit gescheiden volgens hun iso-elektrisch punt (pI) van isoelectrofocusing (IEF). Meer bepaald wordt een elektrische potentiaal aangebracht over de Immobiline acrylamide strips onder een pH-gradiënt en dan eiwitten zal migreren en zich richten op een bepaalde pI in functie van de globale netto-lading. 2) Isoelectrically gericht eiwitten denatureren en negatief geladen door toevoeging van natriumdodecylsulfaat (SDS), waardoor eiwitten in de eerste structuur gescheiden afhankelijk van hun schijnbaar molecuulgewicht (MW) van SDS-PAGE ^3. Deze twee verschillende eigenschappen kunnen we een dubbele waarde aan in de studie van het proteoom verder gaan aanpakken. Enerzijds Deze benadering biedt de mogelijkheid om een ​​kwantitatieve analyse uit te voeren met minimale kleurstoffen 2D-DIGE methode en anderzijds een qualitative analyse door mini-2DE gekoppeld aan western blotting.

Kwantitatieve analyse van 2D-DIGE schenkt eiwit expressie verandert over de hele steekproef proteoom. In het kort worden monsters gelabeld met drie cyaninen (Cy2, Cy3 en Cy5) emitteert bij drie verschillende golflengten (blauw, groen en rood). Deze fluor minimale kleurstoffen die N-hydroxy-succinimidyl ester groep reageren met de ε-aminogroep van lysines residuen van eiwitten waardoor covalente amide bindingen ^4. Lysineresiduen zijn gelabeld slechts tussen de 1-3% en dus meerdere labels toevoeging per eiwit en grote netto lading wijzigingen ^{5, 6} voorkomen. Cy3 en Cy5 worden vaak gebruikt om twee onafhankelijke steekproeven benoemen terwijl Cy2 labels een mengeling van gelijke delen van de monsters te vergelijken. De twee belangrijkste voordelen zijn dat alle gelabelde monsters zijn gemengd en IEF en SDS-PAGE worden uitgevoerd in een gel uitgevoerd in een keer voor elke stap, het vermijden van de inter variabiliteit onder experimenten te wijten aan vergelijking gels. Bovendien presenteert een hoge detectiegrens van circa 1 femtomole eiwit ^7. Gels worden gescand en 2D software vergelijkt het 2D gel fluorescentie afbeeldingen waar Cy2 dient als interne standaard ter identificatie van statistische verschillen tussen de plaatsen voor de achterste identificatie door massaspectrometrie. De 2D analyse software met de interne standaard bereikt een snelle detectie van minder dan 10% verschillen tussen monsters met meer dan 95% van statistische betrouwbaarheid ^8.

Kwalitatieve analyse door mini-2DE is een cruciale stap voor eiwitkarakterisering. Het principe is hetzelfde als eerder beschreven voor pI en MW scheiding, maar in dit geval eiwitten die door een kleine polyacrylamidegel naar een membraan en immunoblotting wordt daarna uitgevoerd. Terwijl een dimensie gelelektroforese bepaald veranderingen in eiwitexpressie voor een of meer eiwitten epitopen in functie van het antilichaam, de informatin van mini-2DE begiftigt met twee extra parameters. Ten eerste, het eiwit isovariants veranderen in functie van de PI, wat aangeeft dat post-translationele modificaties zou kunnen plaatsvinden. Ten tweede mag de massa van identificatie spectrometrie indicatief plausibele zymogenen en katabole producten van eiwitten. Daarom wijzigingen waargenomen door 2D-DIGE zijn waarschijnlijk een aanwijzing voor de mechanismen die ten grondslag liggen aan veranderingen in de wereldwijde proteoom profiel. De aanpassing van het immunoblots tussen verschillende monsters voor hetzelfde eiwit epitoop / s door mini-2DE kan zuurgraad veranderingen die licht werpen in post-translationele variaties iets waargenomen of zelfs niet door monodimensional immunoblotten ^{9, 10} weerspiegelen. Bovendien, deze analyse informeert over de mogelijke splitsingsplaatsen vanwege de kennis van de pI en MW van de metabolische residuen ^11,12.

De combinatie van deze twee technieken biedt een aanvullende proteomics analyse. Aan de ene kant 2D-DIGE biedt een type verschillen waardoor een nauwkeurige isolatie van polypeptiden waarvan de expressie is anders. Deze verschillen bestaan ​​in hoofdzaak in het uiterlijk of de verdwijning van een plek of toename / afname van de intensiteit van een gegeven een door software analyse van de tl-gels. Deze vaststellingen zelf waarschijnlijk niet de aard van de wijziging waargenomen verklaren. Daarom, wanneer het polypeptide wordt geïsoleerd en geïdentificeerd door massaspectrometrie, het gebruik van mini-2DE kunnen precies bevestiging 1) de identiteit van het eiwit geïsoleerd en 2) de aard van de verschil verandering in de isovariant / isovorm niveau expressie, post-translationele modificaties en splitsing werkwijzen bijvoorbeeld. Het is echter noodzakelijk om een ​​conferentie lysisbuffer beide geschikt voor 2D-DIGE en mini-2DE om mogelijke dispersies door het gebruik van extractie protocollen die zeer verschillend beperken ontwikkelen.

In dit artikel, we Debeschreven een aangepast protocol voor de voorbereiding, de winning en de prestaties van 2D-DIGE en mini-2DE technieken voor de hersenen eiwitten afkomstig van mens en muis weefsel.