Un flux Essai d'adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Une. Microslide Préparation Pré-revêtement d'une microplaque à six canaux avec la queue de rat de collagène de type I (RTC, dilué au 1:100 dans du PBS donnant une dilution de travail de 220 pg / ml). Ceci est réalisé en injectant 30 ul d'une solution diluée RTC directement dans les canaux et en incubant pendant 2 heures à 37 ° C, suivie de trois lavages avec du PBS. 2. Les cellules d'ensemencement en microplaques Dissocier un flacon T75 confluente de cellules hépatiques humaines cultivées sinusoïdales endothéliales (SSEC) (isolé à partir de tissu de foie comme décrit précédemment 13) dans de la trypsine-EDTA, les laver dans du PBS, et remettre en suspension à 3 x 10 6 cellules / ml dans du milieu complet (endothéliales humaines support de base supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et de la streptomycine 100μg/ml, 10% de sérum AB humain inactivé à la chaleur, 10 ng / ml de facteur de croissance vasculaire endothéliale et de 10 ng / ml d'hépatocytes facteur de croissance). Injecter 30 ul de suspension cellulaire désastreusescte dans chaque canal. Laisser cellules d'adhérer pendant 1 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec une atmosphère de CO 2 de 5% sur une grille coulissante. Après avoir laissé les cellules adhérer à remplir les orifices de chaque côté de chaque canal avec le milieu complet (figure 1). 3. Stimulation des cellules cytokine Laisser les cellules dans l'incubateur pendant 24 heures. Évaluer la croissance des cellules en utilisant un microscope à contraste de phase inversé. 24 heures avant l'essai d'adhérence, de stimuler les monocouches endotheliales avec des cytokines en remplaçant le milieu de croissance avec du milieu complet supplémenté en facteur de nécrose tumorale alpha et de l'interféron gamma, les deux à 10 ng / ml. 4. Isolement des lymphocytes du sang périphérique Isoler des lymphocytes du sang périphérique à partir de sang total en purifiant d'abord la fraction mononucléaire par centrifugation en gradient de densité sur un milieu de centrifugation de séparation de cellules approprié pendant 25 min à 800x g. Incuber les cellules de plastique pendant 1 heure pour permettre l'adhérence des monocytes. Après l'adhésion à aspirer plastique lymphocyte enrichi surnageant. Laver les lymphocytes et les remettre en suspension (typiquement de 1 x 10 6 cellules / ml dans un milieu d'écoulement (milieux de base endotheliales contenant 0,1% (v / v) d'albumine de sérum bovin (BSA)). 5. Prétraitement de l'endothélium ou leucocytes avec inhibiteurs Préparer des dilutions recommandées de la fonction de blocage des anticorps ou des inhibiteurs de petites molécules de l'endothélium media/0.1% (v / v) de BSA. Remplacer le milieu complet avec la solution de blocage anticorps / inhibiteur dans le canal de microplaque choisi 30 min avant de s'écouler dosage. Lorsque le prétraitement des récepteurs de chimiokines sur les lymphocytes sont prévues, remettre en suspension les leucocytes isolés dans une solution de RPMI contenant 0,1% (v / v) de BSA et incuber avec 200 ng / ml de la toxine coquelucheuse pour bloquer la protéine G activité de récepteur couplé à des récepteurs de chimiokines, en alternative diluer spécifique fonctiondes anticorps de blocage ou des inhibiteurs à petites molécules de récepteurs de chimiokine à la dilution recommandée. Incuber leucocytes à 37 ° C pendant 30 min, puis laver et remettre en suspension dans un milieu d'écoulement. 6. Configuration des flux de système de dosage Préchauffer une chambre transparente à commande thermostatique de 37 ° C. La chambre doit avoir des orifices pour l'insertion d'un tube de silicone et la fourniture électronique d'une électrovanne qui permet à commutation électronique entre les cellules et le milieu pratiquement sans volume mort. L'enceinte est montée sur un microscope inversé pour permettre la microscopie à contraste de phase. Figure 2 montre la chambre de dosage d'écoulement et le microscope et microlame placé sur la platine du microscope. Pré-remplir une seringue en verre de 50 ml avec un luer lock avec 10 ml d'eau distillée stérile et attacher une longueur de tube en silicone de 25 cm de l'orifice de la seringue. Insérer dans une pompe à seringue. Altérer le débit de la pompe de seringue de prélèvement selon lales instructions du fabricant de la microplaque pour maintenir une contrainte de cisaillement de 0,05 Pa (0,5 dyne / cm 2, figure 3). Prenez deux seringues de 5 ml, jeter les plongeurs et fixer les barils pour les deux ports de flux d'une électrovanne électronique en utilisant un tube de silicone. Attacher de 12 cm de tube de silicone à la soupape de sortie de flux. La valve permet l'alternance entre une connexion d'un tampon de lavage de cellules (endothéliales de media/0.1% (v / v) de BSA) et la suspension de lymphocytes. Rincer l'électrovanne électronique par l'insertion du tampon de lavage dans les deux corps de seringue et assurant tampon s'écoule d'un canon à travers la soupape et dans le tube de silicone de sortie de flux. Utiliser le commutateur de vanne à alternance à l'autre cylindre et d'assurer le tampon est fluide et que toutes les bulles sont éliminées du système. Retirez le tampon de lavage de l'un des barils et la remplacer par une suspension de lymphocytes figure 4a. Connectez le tubin de siliconeg à partir de la pompe à seringue à un orifice d'un canal de microplaque choisi par l'intermédiaire d'un adaptateur de microplaque. Ensuite, connecter le tube de silicone à partir de la soupape d'échappement opposée à l'orifice par l'intermédiaire d'un adaptateur de microplaque. Assurez-vous que le tube de silicone et les adaptateurs sont remplis avec du tampon de lavage avant la connexion pour empêcher les bulles d'air entrant dans le système (figure 4b). Une fois connecté au système d'écoulement, placer la microplaque sur la platine du microscope et fixer avec des agrafes ou de ruban adhésif pour empêcher le mouvement. Régler le microscope à l'objectif 10X avec le réglage de phase approprié. S'assurer que la monocouche endothéliale est visualisée et la mise au point en utilisant la lentille oculaire. S'assurer que les images peuvent être capturées par l'intermédiaire d'un appareil photo qui est fixé sur le microscope grâce à quoi les images peuvent être transmises à un écran et enregistrées. 7. Débit de dosage Technique et enregistrement de l'adhérence pour l'analyse Perfuser la couche endothéliale avec du tampon de lavage pendant 2 minutes en commençant withdrawal de la pompe de la seringue pour enlever les débris ou anticorps bloquant non lié, puis passer la vanne pour permettre à 5 min bolus de solution de leucocytes à une contrainte de cisaillement de paroi constante de 0,05 Pa. Pendant les 2 dernières minutes du bol de leucocytes, enregistrer 10 champs aléatoires le long de la longueur de la microplaque. Cela permet une analyse hors ligne des lymphocytes roulement / modem sur la monocouche endothéliale. Enregistrer chaque domaine pour environ 10 secondes avant de passer à la prochaine et veiller à ce que les enregistrements sont effectués sur le sens de l'écoulement pour éviter l'enregistrement deux fois de suite la même cellule de roulement. Suivre le bolus de leucocytes avec un bolus de 5 min de tampon de lavage par retour de la soupape à sa position de départ. Au cours de la 2 min finale de ce bolus effectuer une deuxième phase d'enregistrement en choisissant au moins 10 champs choisis au hasard le long de la longueur de la microplaque. Enregistrer chaque champ pendant environ 5 secondes avant de passer à la prochaine et veiller à ce que la monocouche endothéliale et leucoc adhérentytes sont en orientation claire. Ceci permet une analyse hors ligne du motif d'adhérence.