Isolering av CA1 Nuclear anrikade Fraktioner från hippocampus skivor att studera aktivitetsberoende Nuclear Import av Synapto-nukleära Messenger Proteiner
Summary
Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för induktion av långvarig potentiering i CA1-regionen i hippocampus och efterföljande isolering av kärn anrikade fraktioner från tetanized område av segmentet. Kan användas för detta tillvägagångssätt för att bestämma aktiviteten beroende kärnprotein import i cellulära modeller för inlärning och minne.
Abstract
Studera aktivitet beroende proteinuttryck, subcellulär sloka eller fosforylering är viktigt att förstå de bakomliggande cellulära mekanismer för synaptisk plasticitet. Långsiktig potentiering (LTP) och långtidsdepression (LTD) induceras i akut hippocampus skivor är allmänt accepterade som cellulära modeller för inlärning och minne. Det finns många studier som använder levande cell imaging eller immunohistokemi metoder för att visualisera aktivitetsberoende proteindynamik. Men dessa metoder är beroende av lämpligheten av antikroppar för immuncytokemi eller överuttryck av fluorescens-märkta proteiner i enskilda nervceller. Immunoblotting av proteiner är en alternativ metod som ger oberoende bekräftelse av resultaten. Den första begränsande faktor vid framställningen av subcellulära fraktioner från individuella tetanized hippocampus skivor är den låga mängd material. För det andra är avgörande för handläggningen eftersom även mycket korta och små manipulationer av living skivor kan framkalla aktivering av vissa signaleringskaskader. Här beskriver vi en optimerad arbetsflödet i syfte att få en tillräcklig mängd av kärn anrikad fraktion av tillräcklig renhet från CA1-regionen av akuta hippocampus skivor från råtthjärna. Som ett representativt exempel vi visar att ERK1 / 2 fosforylerad form av synapto-kärnprotein budbärare Jacob translokerar aktivt till kärnan vid induktion av LTP och kan detekteras i en nukleär fraktion från CA1 nervceller.
Introduction
Synaptic N-metyl-D-aspartat-receptorer (NMDARs) spelar en avgörande roll i synaptisk plasticitet och cellöverlevnad signalering medan aktivering av extrasynaptic NMDARs kan utlösa neurodegeneration och celldöd. Dessa förändringar beror på hårt kontrollerad / reglerad verksamhet beroende genuttryck och därmed kräver ständig kommunikation mellan aktiverade synapser eller dendriter och kärnan 7. The MAP-kinaser ERK1 / 2 är nedströms effektorer av synaptiska NMDARs signalering och är involverade i NMDAR-aktivering inducerad genexpression, medan signalering via extrasynaptic NMDAR har ingen eller en hämmande effekt på ERK1 / 2 aktivitet 8,11.
Det finns många proteiner som har visat sig skytteltrafik mellan distala dendriter och kärnan. Många av dessa proteiner innehåller en nukleär lokaliseringssignal och är aktivt transporteras längs microtubuli i en dynein och Importin beroende sätt till kärnan 6,9. Interestingly, vissa av dessa budbärare enbart transit till kärnan som svar på specifika synaptiska stimuli. Till exempel är retrograd transport av cykliskt AMP responselement bindande protein 2 (CREB2) induceras av kemiska LTD men inte LTP 12. Lokaliserad NMDAR beroende synaptisk stimulering driver CREB reglerade transkriptions samaktivator (CRTC1) in i kärnan, en translokationsprocessen, som är involverad i den långsiktiga hippocampus plasticitet 4. Det har nyligen visat att proteinet budbäraren Jacob translokerar till kärnan efter både synaptiska och extrasynaptic NMDAR aktivering och reglerar CREB beroende gentranskription 5. Den synaptiska eller extrasynaptic ursprung signalen är kodad i en posttranslationell modifiering av Jacob. Synaptic aktivitet inducerar ERK1 / 2 beroende fosforylering av Jacob vid en avgörande serin vid position 180 (pJacobS 180) vilket är en förutsättning för den efterföljande transloka till kärnan i primär hippocampus kulturen. Dessutom, jagn CA1 nervceller i akuta hippocampus skivor pJacobS 180 translokerar till kärnan efter Schaffer säkerheter LTP men inte LTD 1,10. pS180 Jacob leder till ett ökat uttryck av plasticitet relaterade gener och detta genuttryck matar tillbaka till synaptisk funktion. I skarp kontrast, Jacob som translokerar till kärnan efter extrasynaptic NMDARs aktivering inte fosforyleras vid Ser180 och kan vara förknippade med olika proteinkomplexet i kärnan orsakar 'CREB avstängning "och en tillbakadragning av synaptiska kontakter 10.
Mest publicerade studier om den nukleära importen av synapto-nukleärt protein budbärare har gjorts i dissocierade neuronala primära kulturer. Därför skulle det vara intressant att se om dessa fynd kan reproduceras i fysiologiskt mer relevanta förhållanden med hjälp av hippocampus skivor där nervkopplingar och funktion är mycket bättre bevarade. Här presenterar vi ett optimerat protokoll för bedömning av LTP-devidhängande nukleär translokation av protein budbärare genom immunoblotting. Denna metod är också lämplig för att analysera aktiviteten beroende fosforylering av proteiner i en rå kärnfraktion. Specifikt handlar det nuvarande protokollet beredningen av akuta CA1 hippocampus skivor, induktion och inspelning av LTP. Därefter CA1 regionen mikroskopiskt dissekeras att isolera den stimulerade området. Vi kombinerade och ändrat protokollet för kärnkrafts isolering från CellLytic Nuclear Extraction Kit med ändringar som införts av Zhao och kollegor 17. Den optimerade förfarande omfattar lys av dissekerade CA1 regioner hypoton buffert möjliggör cellsvullnad och frisättning av kärnor. Cellys och kärnorna morfologi kan bestämmas genom mikroskopisk undersökning. Kärn berikning uppnås genom en kort centrifugeringssteg. Immunanalys med antikroppar mot NeuN och NSE2, specifika markörer av nukleära eller cytosoliska fraktioner, indikerar att denna metod kan användas som en snabboch reproducerbar protokoll för att isolera dessa subcellulära fraktioner och studera mycket labila posttranslationella modifieringar som proteinfosforylering. Dessutom är denna metod fördelaktig för små vävnadsprover som härrör från dissekerade CA1 regioner i hippocampus skivor och kan användas i kombination med immunohistokemi av hippocampus skivor.
Protocol
Representative Results
Discussion
De åtgärder som beskrivs i protokollet ovan ger vägledning hur man förbereder hippocampus akut klippt från unga eller vuxna råttor, framkalla och spela LTP, snabbt dissekera stimulerad område skiva, och förbereda nukleär fraktion för att studera aktivitetsberoende proteindynamik. Detta tillvägagångssätt härrör från kombination av flera olika metoder som används oberoende av varandra. Vi optimerat ett arbetsflöde och ger tillräckligt detaljerad för nybörjaren att inrätta egna experiment för att stu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.
Materials
| Table 1. Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Axopatch 200B amplifier | Axon，USA | ||
| Axon Digidata acquisition system | Axon，USA | ||
| Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software | Axon，USA | ||
| Leica microscope | Leica TCS SP2，Germany | ||
| P-97 Standard microelectrode puller | Sutter，USA | ||
| Stereomicroscope | Leica | Leica S4E, Germany | |
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | Model2100, A-M systmes, USA | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17 | ||
| SDS-PAGE system | BIORAD | ||
| Cooler | JULABO | ||
| Bright field Microscope | NIKON ECLIPSE TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation, HERAEUS | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco | ||
| Cooler | Julabo, F12 | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17 | ||
| Submerged type Recording Chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Table 2. Reagents | |||
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| NaCl | ROTH | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| KCl | ROTH | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| CaCl2·2H2O | MERCK | 1.02382.0500 | pro analysi |
| MgSO4·2H2O | MERCK | 5886.05 | pro analysi |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for Molecularbiology |
| KH2PO4 | MERCK | 12034.025 | for Molecularbiology |
| Na2HPO4·2H2O | MERCK | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | ROTH | Art.-Nr.6887.1 | for Molecularbiology |
| Hepes | ROTH | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | MERCK | 1.06329.1000 | pro analysi |
| Protease inhibitor Coctail | ROCHE | ||
| Phosphostop | ROCHE | ||
| Bicuculline | Tocris bioscience | ||
| Isofluran | Baxter | ||
| Table 4. Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes/ purified | rabbit (dil. 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (dil. 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (dil. 1:1,000) |
| beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (dil. 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Species | ||
| IgG HRP Conjugated | DAKO | goat anti – mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP Conjugated | NEB | goat anti – rabbit (1:5,000) |
Referenzen
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neurowissenschaften. 169 (4), 1520-1526 (2010).
- Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
- Ch’ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O’Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
- Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
- Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again–communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
- Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
- Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
- Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
- Lai, K. O., Zhao, Y., Ch’ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neurowissenschaften. 131 (3), 601-610 (2005).
- Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
- Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
- Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).
