Выделение СА1 ядерного Обогащенный фракций из срезов гиппокампа для изучения деятельности зависит от ядерного импорта из Synapto-ядерных Messenger, белков
Summary
Мы предоставляем подробный протокол для индукции длительной потенциации в СА1 области гиппокампа и последующего выделения ядерных обогащенных фракций от tetanized области среза. Этот подход может быть использован для определения активности в зависимости импорт ядерного белка в клеточных моделей обучения и памяти.
Abstract
Изучение активности выражение зависимый белок, субклеточная транслокация или фосфорилирования важно понять основные клеточные механизмы синаптической пластичности. Долгосрочный потенциация (LTP) и длительная депрессия (ООО), индуцированный в острых срезов гиппокампа широко признаны как клеточных моделях обучения и памяти. Существуют многочисленные исследования, которые используют живых изображений сотовый или иммуногистохимии подходы к визуализации активности динамику зависимые белковые. Однако эти способы основаны на пригодность антител для иммуноцитохимии или гиперэкспрессией флуоресценции с метками белков в отдельных нейронов. Иммуноблоттинг белков является альтернативным методом обеспечили подтверждение выводов. Первый ограничивающим фактором в получении субклеточных фракций из отдельных tetanized срезах гиппокампа является низкое количество материала. Во-вторых, процедура обработки имеет решающее значение, потому что даже очень коротких и незначительных манипуляций лiving ломтики может вызвать активацию определенных сигнальных каскадов. Здесь мы описываем оптимизированный рабочий процесс, чтобы получить достаточное количество ядерного обогащенной фракции достаточной чистоты от СА1 области острых срезах гиппокампа из мозга крысы. В качестве типичного примера показывают, что ERK1 / 2 фосфорилированный форма synapto-ядерного белка мессенджера Jacob активно перемещает к ядру при индукции LTP и могут быть обнаружены в ядерном обогащенной фракции от СА1 нейронов.
Introduction
Synaptic N-метил-D-аспартат-рецепторы (NMDARs) играют ключевую роль в синаптической пластичности и выживаемость клеток сигнализации в то время активации внесинаптических NMDARs может вызвать нейродегенерации и гибель клеток. Эти изменения зависят от жестко контролируемой / регулируемой деятельности выражения зависит генов и, следовательно, требуют постоянного общения между активированными синапсов или дендритов и ядра 7. MAP киназ ERK1 / 2 являются нижестоящими эффекторами синаптических NMDARs сигнализации и не участвуют в экспрессии генов NMDAR-активация-индуцированной, в то время как сигнализации через внесинаптического NMDAR не имеет или тормозящее действие на ERK1 / 2 деятельности 8,11.
Есть ряд белков, которые были показаны, чтобы курсировать между дистальных дендритов и ядра. Многие из этих белков содержит сигнал ядерной локализации и активно транспортируется вдоль микротрубочками в динеина и импортина-зависимым образом в ядро 6,9. Interestinglу, некоторые из этих мессенджеров только транзит в ядре в ответ на конкретные синаптических раздражители. Например, ретроградная транспорт циклического АМФ элемента ответа связывающий белок 2 (CREB2) индуцируется химической ООО, но не LTP 12. Локализованные NMDAR-зависимой синаптической стимуляции приводит CREB-регулируется транскрипции коактиватор (CRTC1) в ядро, процесс транслокации, которая участвует в долгосрочной гиппокампа пластичности 4. Недавно было показано, что посланник белок Иаков транслоцируется в ядро после как, синаптической и внесинаптического активации NMDAR и регулирует CREB зависит транскрипцию гена 5. Синаптической или внесинаптического происхождение сигнала кодируется в посттрансляционной модификации Иакова. Синаптической активности индуцирует ERK1 / 2 зависимое фосфорилирование Иакова в решающий серин в положении 180 (pJacobS 180), который является необходимым условием для последующего транслокации в ядро в первичной гиппокампа культуры. Более того, ян CA1 нейронов острых срезов гиппокампа pJacobS 180 перемещается в ядро после Шаффер залога ЛТП, но не LTD 1,10. pS180 Иаков приводит к повышенной экспрессии пластичности связанных генов и это выражение гена каналы обратно в синаптической функции. В резком контрасте, Иаков, что перемещается в ядро после внесинаптического NMDARs активация не фосфорилируется в Ser180 и могут быть связаны с различными белкового комплекса в ядре в результате чего 'CREB отключить' и втягивание синаптических контактов 10.
Большинство опубликованных исследований по ядерной импорта synapto-ядерного белка посланника было сделано в диссоциированных нейронов первичных культурах. Поэтому было бы интересно посмотреть, если такие выводы могут быть воспроизведены в физиологически более актуальными условия, используя срезах гиппокампа, где нейронная связь и функция гораздо лучше сохраняются. Здесь мы представим оптимизированный протокол для оценки LTP-деКулон ядерную транслокацию белка посланников иммуноблоттингом. Этот способ также подходит для анализа активности зависимое фосфорилирование белков в сырой ядерной фракции. В частности, текущий протокол включает получение острых срезов СА1 гиппокампа, индукции и записи ЛТП. Далее, СА1 область под микроскопом рассекают, чтобы изолировать область стимулированного. Мы объединили и изменение протокол для ядерной изоляции, предоставленную CellLytic ядерной Extraction Kit с изменениями, внесенными Чжао и его коллеги 17. Оптимизированная процедура включает лизис расчлененных СА1 регионов в гипотонического буфера, позволяющее клеток опухоли и высвобождение ядер. Лизис клеток и морфологию ядра может быть определена с помощью микроскопического исследования. Ядерный обогащение достигается стадией короткого центрифугирования. Иммуноблоттинг анализ с антителами против NeuN и NSE2, специфических маркеров ядерных или цитозольных фракций, указывает на то, что этот подход может быть использован в качестве быстрогои воспроизводимый протокол изолировать эти субклеточные фракции и учиться очень неустойчивые посттрансляционные модификации как фосфорилирования белков. Кроме того, этот способ выгоден маленькие образцы ткани, вытекающих из вскрытых СА1 регионах срезах гиппокампа и могут быть использованы в комбинации с иммуногистохимии в срезах гиппокампа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанные в предыдущем протоколе дать указания, как подготовить гиппокампа острый нарезанный из молодых или взрослых крыс, индуцировать и запись LTP, быстро вскрыть вынужденное площадь среза, и подготовить ядерную обогащенную фракцию для изучения активности динамику зависимые белков?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.
Materials
| Table 1. Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Axopatch 200B amplifier | Axon，USA | ||
| Axon Digidata acquisition system | Axon，USA | ||
| Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software | Axon，USA | ||
| Leica microscope | Leica TCS SP2，Germany | ||
| P-97 Standard microelectrode puller | Sutter，USA | ||
| Stereomicroscope | Leica | Leica S4E, Germany | |
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | Model2100, A-M systmes, USA | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17 | ||
| SDS-PAGE system | BIORAD | ||
| Cooler | JULABO | ||
| Bright field Microscope | NIKON ECLIPSE TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation, HERAEUS | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco | ||
| Cooler | Julabo, F12 | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17 | ||
| Submerged type Recording Chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Table 2. Reagents | |||
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| NaCl | ROTH | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| KCl | ROTH | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| CaCl2·2H2O | MERCK | 1.02382.0500 | pro analysi |
| MgSO4·2H2O | MERCK | 5886.05 | pro analysi |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for Molecularbiology |
| KH2PO4 | MERCK | 12034.025 | for Molecularbiology |
| Na2HPO4·2H2O | MERCK | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | ROTH | Art.-Nr.6887.1 | for Molecularbiology |
| Hepes | ROTH | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | MERCK | 1.06329.1000 | pro analysi |
| Protease inhibitor Coctail | ROCHE | ||
| Phosphostop | ROCHE | ||
| Bicuculline | Tocris bioscience | ||
| Isofluran | Baxter | ||
| Table 4. Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes/ purified | rabbit (dil. 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (dil. 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (dil. 1:1,000) |
| beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (dil. 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Species | ||
| IgG HRP Conjugated | DAKO | goat anti – mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP Conjugated | NEB | goat anti – rabbit (1:5,000) |
Referenzen
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neurowissenschaften. 169 (4), 1520-1526 (2010).
- Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
- Ch’ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O’Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
- Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
- Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again–communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
- Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
- Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
- Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
- Lai, K. O., Zhao, Y., Ch’ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neurowissenschaften. 131 (3), 601-610 (2005).
- Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
- Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
- Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).
