Isolamento de CA1 Nucleares frações enriquecidas de fatias do hipocampo para o Estudo de dependentes de Atividade Nuclear Importação de Mensageiro Proteínas Synapto nucleares
Summary
Nós fornecer um protocolo detalhado para a indução de potenciação de longo prazo na região CA1 do hipocampo e o subsequente isolamento de fracções enriquecidas nucleares da área tetanized da fatia. Esta abordagem pode ser utilizada para determinar a actividade da importação nuclear de proteína dependente em modelos celulares de aprendizagem e memória.
Abstract
Estudar expressão atividade da proteína dependente, translocação subcelular, ou fosforilação é essencial para compreender os mecanismos celulares subjacentes à plasticidade sináptica. A potenciação de longa duração (LTP) e depressão a longo prazo (LTD) induzida em fatias de hipocampo agudas são amplamente aceites como modelos celulares de aprendizagem e memória. Existem inúmeros estudos que utilizam abordagens de imagiologia celular ou imunohistoquímica ao vivo para visualizar a atividade dinâmica de proteínas dependentes. No entanto, estes métodos dependem da adequação de anticorpos para imunocitoquímica ou superexpressão de proteínas marcadas com fluorescência em neurônios individuais. Immunoblotting de proteínas é um método alternativo que oferece confirmação independente dos resultados. O primeiro factor limitativo na preparação de fracções subcelulares de fatias de hipocampo tetanized individuais é a baixa quantidade de material. Em segundo lugar, o procedimento de tratamento é fundamental, porque manipulações muito curtos e menores de lumprir fatias pode induzir a ativação de algumas cascatas de sinalização. Aqui, descrevemos um processo de produção optimizado, a fim de obter uma quantidade suficiente de uma fracção enriquecida nuclear de pureza suficiente da região CA1 do hipocampo agudas fatias de cérebro de rato. Como um exemplo representativo, mostra-se que a ERK1 / 2 forma fosforilada da proteína mensageira synapto nuclear Jacob activamente transloca para o núcleo mediante indução da LTP e pode ser detectada numa fracção enriquecida nuclear de neurónios CA1.
Introduction
Synaptic N-metil-D-aspartato-receptores (NMDAR) desempenham um papel crucial na plasticidade sináptica e a sobrevivência das células de sinalização enquanto a activação de NMDAR extrasynaptic pode provocar neurodegeneração e morte celular. Essas mudanças dependem de expressão rigidamente controlado gene dependente / atividade regulamentada e, portanto, requerem uma comunicação constante entre sinapses ativadas ou dendritos e do núcleo 7. O MAP-quinases ERK1 / 2 são efectores a jusante de sinalização de NMDAR sinápticas e são envolvidos na expressão de genes induzidos por NMDAR-activação, enquanto que a sinalização através de NMDAR extrasynaptic não tem ou tem um efeito inibidor sobre a ERK1 / 2 atividade 8,11.
Há um número de proteínas que têm sido mostrados para transporte entre dendritos distais e do núcleo. Muitas destas proteínas conter um sinal de localização nuclear e são activamente transportados ao longo de microtúbulos em uma maneira dependente da dineína e-importin 6,9 para o núcleo. Interestingly, alguns destes mensageiros trânsito apenas para o núcleo, em resposta a estímulos específicos sinápticos. Por exemplo, o transporte retrógrado de elemento de resposta cíclica AMP ligação às proteínas 2 (CREB2) é induzida por LTD química, mas não LTP 12. Localizada estimulação sináptica dependente de NMDAR impulsiona coactivador de transcrição regulada de CREB (CRTC1) para o núcleo, um processo de translocação, que está envolvida na plasticidade do hipocampo a longo prazo 4. Foi demonstrado recentemente que o mensageiro proteína Jacob transloca para o núcleo após tanto, a activação sináptica e extrasynaptic NMDAR e regula CREB gene dependente de transcrição 5. A origem sináptica ou extrasynaptic do sinal é codificado em uma modificação pós-tradução de Jacob. Actividade sináptica induz ERK1 / 2 dependente da fosforilação de serina-Jacob numa cruciais na posição 180 (pJacobS 180), que é um requisito necessário para a subsequente translocação para o núcleo, em cultura primária do hipocampo. Além disso, in neurônios CA1 de fatias de hipocampo agudas pJacobS 180 transloca para o núcleo após Schaffer garantia LTP mas não LTD 1,10. PS180 Jacob leva a um aumento da expressão de genes relacionados com a plasticidade e a expressão do gene realimenta a função sináptica. Em nítido contraste, Jacob que transloca para o núcleo após a ativação NMDAR extrasynaptic não é fosforilada na Ser180 e pode estar associada a diferentes complexos proteína no núcleo causando 'CREB desligado' e uma retração de contatos sinápticos 10.
A maioria dos estudos publicados sobre a importação nuclear de synapto-nuclear mensageiro proteína ter sido feito em culturas primárias de neurônios dissociados. Por isso, seria interessante ver se esses resultados podem ser reproduzidos em fisiologicamente mais relevante condições usando fatias de hipocampo onde a conectividade e função neuronal são muito mais bem preservado. Aqui apresentamos um protocolo otimizado para avaliação LTP-dependent translocação nuclear de mensageiros proteicos por imunotransferência. Este método também é adequado para a análise da actividade de fosforilação de proteínas dependentes de uma fracção nuclear em bruto. Especificamente, o protocolo atual envolve a preparação de fatias aguda CA1 do hipocampo, indução e gravação de LTP. Em seguida, a região CA1 é microscopicamente dissecados para isolar a região estimulada. Nós combinamos e modificou o protocolo para o isolamento nuclear fornecido pela CellLytic nuclear Extraction Kit com alterações introduzidas pela Zhao e seus colegas 17. O procedimento optimizado inclui a lise das regiões CA1 dissecados em tampão hipotónico permitindo inchaço celular e a libertação de núcleos. A lise celular e morfologia de núcleos pode ser determinado por exame microscópico. Enriquecimento nuclear é conseguida por um passo de centrifugação curta. Immunoblotting análise com anticorpos contra NeuN e NSE2, marcadores específicos de fracções nucleares ou citosólicas, indica que esta abordagem pode ser usada como um rápidoe protocolo reprodutível para isolar essas frações subcelulares e estudar modificações pós-tradução muito instáveis, como a fosforilação de proteínas. Além disso, este método é vantajoso para pequenas amostras de tecido derivadas de regiões CA1 dissecados de fatias do hipocampo e pode ser usado em combinação com imuno-histoquímica de fatias do hipocampo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os passos descritos no protocolo acima fornecer orientações como preparar hipocampo aguda fatias de ratos jovens ou adultos, induzir e registro LTP, dissecar rapidamente área estimulada de fatia, e preparar fração enriquecida nuclear para estudar a atividade dinâmica de proteínas dependentes. Esta abordagem resulta da combinação de vários métodos diferentes utilizados independentemente um do outro. Nós otimizamos um fluxo de trabalho e fornecer detalhes suficientes para o iniciante a criar as suas próprias …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.
Materials
| Table 1. Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Axopatch 200B amplifier | Axon，USA | ||
| Axon Digidata acquisition system | Axon，USA | ||
| Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software | Axon，USA | ||
| Leica microscope | Leica TCS SP2，Germany | ||
| P-97 Standard microelectrode puller | Sutter，USA | ||
| Stereomicroscope | Leica | Leica S4E, Germany | |
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | Model2100, A-M systmes, USA | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17 | ||
| SDS-PAGE system | BIORAD | ||
| Cooler | JULABO | ||
| Bright field Microscope | NIKON ECLIPSE TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation, HERAEUS | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco | ||
| Cooler | Julabo, F12 | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17 | ||
| Submerged type Recording Chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Table 2. Reagents | |||
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| NaCl | ROTH | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| KCl | ROTH | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| CaCl2·2H2O | MERCK | 1.02382.0500 | pro analysi |
| MgSO4·2H2O | MERCK | 5886.05 | pro analysi |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for Molecularbiology |
| KH2PO4 | MERCK | 12034.025 | for Molecularbiology |
| Na2HPO4·2H2O | MERCK | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | ROTH | Art.-Nr.6887.1 | for Molecularbiology |
| Hepes | ROTH | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | MERCK | 1.06329.1000 | pro analysi |
| Protease inhibitor Coctail | ROCHE | ||
| Phosphostop | ROCHE | ||
| Bicuculline | Tocris bioscience | ||
| Isofluran | Baxter | ||
| Table 4. Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes/ purified | rabbit (dil. 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (dil. 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (dil. 1:1,000) |
| beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (dil. 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Species | ||
| IgG HRP Conjugated | DAKO | goat anti – mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP Conjugated | NEB | goat anti – rabbit (1:5,000) |
Referenzen
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