Isolering av CA1 Nuclear beriket fraksjoner fra hippocampus Slices til studieaktivitet avhengig Nuclear Import av Synapto-nukleære Messenger Proteiner
Summary
Vi gir en detaljert protokoll for induksjon av langsiktig potense i CA1-regionen av hippocampus, og den påfølgende isolering av atom anrikede fraksjoner fra den tetanized område av skiven. Denne tilnærmingen kan brukes til å bestemme aktiviteten avhenger atom protein import i cellulære modeller for læring og hukommelse.
Abstract
Studerer aktivitet avhengig protein uttrykk, subcellulære translokasjon, eller fosforylering er viktig å forstå de underliggende cellulære mekanismene for synaptisk plastisitet. Langsiktig potensering (LTP) og langvarige depresjoner (LTD) indusert i akutte hippocampus skiver er allment akseptert som cellulære modeller for læring og hukommelse. Det er mange studier som bruker levende celle bildebehandling eller immunhistokjemi tilnærminger for å visualisere aktivitets avhengig protein dynamikk. Men disse metodene er avhengige av egnetheten av antistoffer til immunocytochemistry eller overekspresjon av fluorescens-merket proteiner i enkeltnerveceller. Immunoblotting av proteiner er en alternativ metode som gir uavhengig bekreftelse av funnene. Den første begrensende faktor for fremstilling av subcellulære fraksjoner fra individuelle tetanized hippokampale skiver er den lave mengde materiale. For det andre er avgjørende håndtering prosedyren fordi selv svært korte og små manipulasjoner av living skiver kan indusere aktivering av visse signalkaskader. Her beskriver vi en optimalisert arbeidsflyt for å oppnå tilstrekkelige mengder av kjernefraksjonen anriket med tilstrekkelig renhet fra CA1-regionen av akutte hippokampale skiver fra rottehjerne. Som et representativt eksempel viser vi at ERK1 / 2 fosforylert form av synapto-kjerneprotein messenger Jacob translocates aktivt til kjernen ved induksjon av LTP, og kan påvises i et atom beriket fraksjon fra CA1-neuroner.
Introduction
Synaptic N-metyl-D-aspartat-reseptorer (NMDARs) spiller en avgjørende rolle i synaptisk plastisitet og celle overlevelse signale mens aktivering av extrasynaptic NMDARs kan utløse neurodegenerering og celledød. Disse endringene avhenger kontrollert / regulert aktivitet avhengig genuttrykk og dermed krever konstant kommunikasjon mellom aktiverte synapser eller dendritter og kjernen 7. MAP kinaser ERK1 / 2 er nedstrøms effektorer av synaptiske NMDARs signalanlegg og er involvert i NMDAR-aktivering induserte genuttrykk, mens signalering via extrasynaptic NMDAR har ingen eller en hemmende effekt på ERK1 / 2 aktivitet 8,11.
Det er antall proteiner som har vist seg å shuttle mellom distale dendritter og kjernen. Mange av disse proteiner inneholder et kjernelokaliseringssignal, og er aktivt transportert langs mikrotubuli i en dynein og importin avhengig måte til kjernen 6,9. Interestingly, noen av disse budbringere bare transitt til kjernen som respons på spesifikke synaptiske stimuli. For eksempel er retrograd transport av cyklisk AMP responselement bindende protein 2 (CREB2) indusert ved kjemisk LTD, men ikke LTP 12. Lokalisert NMDAR avhengige synaptisk stimulering driver CREB-regulert transcriptional coactivator (CRTC1) inn i kjernen, en trans prosess, som er involvert i langsiktig hippocampus plastisitet fire. Det ble nylig vist at proteinet messenger Jacob translocates til kjernen etter at begge, synaptiske og extrasynaptic NMDAR aktivering og regulerer CREB avhengig gentranskripsjon 5. Den synaptiske eller extrasynaptic opprinnelse av signalet er kodet i et posttranslational modifikasjon av Jacob. Synaptisk aktivitet induserer ERK1 / 2 avhengig fosforylering av Jacob på et viktig serin i posisjon 180 (pJacobS 180) som er en forutsetning for den etterfølgende translokasjon til kjernen i hippocampus primære kultur. Dessuten, in CA1 nevroner av akutte hippocampus skiver pJacobS 180 translocates til kjernen etter Schaffer sikkerhet LTP men ikke LTD 1,10. pS180 Jacob fører til økt uttrykk av plastisitet relaterte gener og dette genuttrykk feeds tilbake til synaptisk funksjon. I skarp kontrast, Jacob som translocates til kjernen etter extrasynaptic NMDARs aktivering ikke fosforyleres på Ser180 og kan være assosiert med ulike proteinkompleks i kjernen forårsaker 'CREB stenge "og et dementi av synaptiske kontakter 10.
Mest publiserte studier om kjernefysisk import av synapto-kjerneprotein messenger har blitt gjort i dissosiert nevronale primærkulturer. Derfor ville det være interessant å se om slike funn kan reproduseres i fysiologisk mer relevant forhold og med hippocampus skiver der neuronal tilkobling og funksjon er mye bedre bevart. Her presenterer vi en optimalisert protokoll for å vurdere LTP-deHENGENDE kjernefysisk translokasjon av protein budbringere av immunoblotting. Denne fremgangsmåte er også egnet for å analysere aktiviteten avhengig fosforylering av proteiner i en rå atomfraksjon. Nærmere bestemt involverer den aktuelle protokoll fremstilling av akutte CA1 hippokampale skiver, induksjon, samt registrering av LTP. Deretter blir CA1 regionen mikroskopisk dissekert for å isolere den stimulerte region. Vi kombinerte og endret protokollen for atom isolasjon levert av CellLytic Nuclear Extraction Kit med endringer introdusert av Zhao og kolleger 17. Den optimaliserte prosedyren omfatter lyse av dissekert CA1 regioner i hypoton buffer slik celle hevelse og frigjøring av kjerner. Cellelyse og nuclei morfologi kan bestemmes ved mikroskopisk undersøkelse. Kjerne anrikning oppnås ved en kort sentrifugeringstrinnet. Immunoblotting analyse med antistoffer mot Neun og NSE2, spesifikke markører for kjernefysiske eller cytosoliske fraksjoner, indikerer at denne tilnærmingen kan brukes som en raskog reproduserbar protokollen for å isolere disse subcellulære fraksjoner og å studere svært labile posttranslational modifikasjoner som protein fosforylering. I tillegg er denne fremgangsmåten fordelaktig ved små vevsprøver som stammer fra dissekert CA1 regioner av hippokampale skiver og kan brukes i kombinasjon for å immunhistokjemi av hippokampale skiver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trinnene som er beskrevet i protokollen ovenfor gi veiledning hvordan å forberede hippocampus akutt skiver fra unge eller voksne rotter, indusere og rekord LTP, raskt dissekere stimulert område av skive, og forberede atom beriket brøkdel for å studere aktivitets avhengig protein dynamikk. Denne fremgangsmåten er avledet fra kombinasjoner av flere forskjellige metoder som brukes uavhengig av hverandre. Vi optimalisert en arbeidsflyt og gi tilstrekkelig detalj for nybegynnere å sette opp sine egne eksperimenter for …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.
Materials
| Table 1. Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Axopatch 200B amplifier | Axon，USA | ||
| Axon Digidata acquisition system | Axon，USA | ||
| Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software | Axon，USA | ||
| Leica microscope | Leica TCS SP2，Germany | ||
| P-97 Standard microelectrode puller | Sutter，USA | ||
| Stereomicroscope | Leica | Leica S4E, Germany | |
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | Model2100, A-M systmes, USA | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17 | ||
| SDS-PAGE system | BIORAD | ||
| Cooler | JULABO | ||
| Bright field Microscope | NIKON ECLIPSE TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation, HERAEUS | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco | ||
| Cooler | Julabo, F12 | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17 | ||
| Submerged type Recording Chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Table 2. Reagents | |||
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| NaCl | ROTH | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| KCl | ROTH | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| CaCl2·2H2O | MERCK | 1.02382.0500 | pro analysi |
| MgSO4·2H2O | MERCK | 5886.05 | pro analysi |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for Molecularbiology |
| KH2PO4 | MERCK | 12034.025 | for Molecularbiology |
| Na2HPO4·2H2O | MERCK | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | ROTH | Art.-Nr.6887.1 | for Molecularbiology |
| Hepes | ROTH | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | MERCK | 1.06329.1000 | pro analysi |
| Protease inhibitor Coctail | ROCHE | ||
| Phosphostop | ROCHE | ||
| Bicuculline | Tocris bioscience | ||
| Isofluran | Baxter | ||
| Table 4. Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes/ purified | rabbit (dil. 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (dil. 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (dil. 1:1,000) |
| beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (dil. 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Species | ||
| IgG HRP Conjugated | DAKO | goat anti – mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP Conjugated | NEB | goat anti – rabbit (1:5,000) |
Referenzen
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neurowissenschaften. 169 (4), 1520-1526 (2010).
- Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
- Ch’ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O’Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
- Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
- Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again–communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
- Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
- Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
- Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
- Lai, K. O., Zhao, Y., Ch’ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neurowissenschaften. 131 (3), 601-610 (2005).
- Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
- Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
- Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).
