Hippocampal स्लाइस से सीए 1 परमाणु समृद्ध भागों के अलगाव Synapto परमाणु मैसेंजर प्रोटीन की गतिविधि पर निर्भर परमाणु आयात अध्ययन
Summary
हम हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र और टुकड़ा के tetanized क्षेत्र से परमाणु समृद्ध अंशों के बाद अलगाव में लंबी अवधि potentiation के शामिल होने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. यह दृष्टिकोण गतिविधि सीखने और स्मृति के सेलुलर मॉडल में निर्भर परमाणु प्रोटीन आयात निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
पढ़ रही गतिविधि निर्भर प्रोटीन अभिव्यक्ति, subcellular स्थानान्तरण, या फास्फारिलीकरण synaptic plasticity की अंतर्निहित सेलुलर तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है. दीर्घकालिक potentiation (एलटीपी) और तीव्र hippocampal स्लाइस में प्रेरित लंबे समय तक अवसाद (लिमिटेड) व्यापक रूप से सीखने और स्मृति के सेलुलर मॉडल के रूप में स्वीकार कर रहे हैं. गतिविधि निर्भर प्रोटीन गतिशीलता कल्पना करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग या immunohistochemistry दृष्टिकोण का उपयोग करने वाले कई अध्ययन कर रहे हैं. हालांकि इन तरीकों एकल न्यूरॉन्स में प्रतिदीप्ति टैग प्रोटीन की immunocytochemistry या overexpression के लिए एंटीबॉडी की उपयुक्तता पर भरोसा करते हैं. प्रोटीन की Immunoblotting निष्कर्षों की स्वतंत्र पुष्टि प्रदान करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका है. व्यक्तिगत tetanized hippocampal स्लाइस से subcellular भिन्न की तैयारी में पहले सीमित कारक सामग्री की कम राशि है. दूसरा, से निपटने की प्रक्रिया महत्वपूर्ण है एल की भी बहुत कम और छोटे जोड़तोड़ क्योंकिस्लाइस iving कुछ cascades संकेत के सक्रियण प्रेरित हो सकता है. यहाँ हम चूहे के मस्तिष्क से तीव्र hippocampal स्लाइस की CA1 क्षेत्र से पर्याप्त शुद्धता के परमाणु समृद्ध अंश की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए एक अनुकूलित कार्यप्रवाह वर्णन. एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में हम synapto परमाणु प्रोटीन मैसेंजर के ERK1 / 2 phosphorylated फार्म याकूब सक्रिय रूप एलटीपी के शामिल होने पर नाभिक को translocates और सीए 1 न्यूरॉन्स से एक परमाणु समृद्ध अंश में पता लगाया जा सकता है.
Introduction
Synaptic एन मिथाइल-D-aspartate रिसेप्टर्स (NMDARs) synaptic plasticity और सेल अस्तित्व neurodegeneration और कोशिका मृत्यु को गति प्रदान कर सकते हैं extrasynaptic NMDARs की सक्रियता जबकि संकेत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इन परिवर्तनों को कसकर नियंत्रित / विनियमित गतिविधि निर्भर जीन अभिव्यक्ति पर निर्भर करती है और इस प्रकार सक्रिय synapses या डेन्ड्राइट और नाभिक 7 के बीच निरंतर संवाद की आवश्यकता होती है. एमएपी ERK1 / 2 संकेत synaptic NMDARs के बहाव प्रभावोत्पादक हैं और extrasynaptic NMDAR के माध्यम से संकेत नहीं या ERK1 / 2 गतिविधि 8,11 पर एक निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है, जबकि NMDAR सक्रियण प्रेरित जीन अभिव्यक्ति में शामिल हैं kinases.
बाहर का डेन्ड्राइट और नाभिक के बीच शटल दिखाया गया है कि प्रोटीन की संख्या में हैं. इन प्रोटीनों की कई एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत होते हैं और सक्रिय रूप से नाभिक 6,9 करने के लिए एक dynein और importin निर्भर ढंग से microtubuli साथ ले जाया जाता है. Interestinglवाई, विशिष्ट synaptic उत्तेजनाओं के जवाब में नाभिक को इन दूतों में से कुछ ही पारगमन. उदाहरण के लिए, चक्रीय एएमपी प्रतिक्रिया तत्व बाध्यकारी प्रोटीन 2 (CREB2) के प्रतिगामी परिवहन रासायनिक लिमिटेड लेकिन नहीं एलटीपी 12 से प्रेरित है. स्थानीयकृत NMDAR निर्भर synaptic उत्तेजना लंबी अवधि के हिप्पोकैम्पस प्लास्टिसिटी 4 में शामिल है जो नाभिक, एक स्थानान्तरण प्रक्रिया में CREB विनियमित ट्रांसक्रिप्शनल coactivator (CRTC1) चलाता है. यह हाल ही में प्रोटीन दूत याकूब दोनों के बाद नाभिक, synaptic और extrasynaptic NMDAR सक्रियण को translocates और CREB निर्भर जीन प्रतिलेखन 5 को नियंत्रित करता है कि दिखाया गया था. संकेत के synaptic या extrasynaptic मूल याकूब के posttranslational संशोधन में इनकोडिंग है. Synaptic गतिविधि प्राथमिक हिप्पोकैम्पस संस्कृति में नाभिक के बाद स्थानान्तरण के लिए एक अपेक्षित है जो स्थिति 180 (pJacobS 180) पर एक महत्वपूर्ण सेरीन पर याकूब के ERK1 / 2 निर्भर फास्फारिलीकरण लाती है. इसके अलावा, मैंn सीए 1 Schaffer जमानत एलटीपी के बाद नाभिक को तीव्र hippocampal स्लाइस pJacobS 180 translocates के न्यूरॉन्स लेकिन नहीं 1,10 लि. pS180 याकूब प्लास्टिसिटी संबंधित जीन का एक बढ़ा अभिव्यक्ति की ओर जाता है और इस जीन अभिव्यक्ति synaptic समारोह को वापस खिलाती है. Extrasynaptic NMDARs सक्रियण Ser180 पर phosphorylated नहीं है और पैदा नाभिक में विभिन्न प्रोटीन जटिल के साथ जुड़ा हो सकता है के बाद नाभिक को translocates कि इसके विपरीत, याकूब में 'CREB बंद' और synaptic संपर्कों 10 के त्याग.
Synapto परमाणु प्रोटीन मैसेंजर के परमाणु आयात पर अधिकांश प्रकाशित अध्ययन अलग न्यूरोनल प्राथमिक संस्कृतियों में किया गया है. न्यूरोनल कनेक्टिविटी और समारोह में ज्यादा बेहतर संरक्षित कर रहे हैं जहां इसलिए यह इस तरह के निष्कर्ष हिप्पोकैम्पस स्लाइस का उपयोग physiologically अधिक प्रासंगिक परिस्थितियों में reproduced किया जा सकता है देखने के लिए दिलचस्प होगा. यहाँ हम एलटीपी-de आकलन करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल पेशimmunoblotting द्वारा प्रोटीन दूतों के परमाणु स्थानान्तरण लटकता हुआ. इस पद्धति का भी एक कच्चे परमाणु अंश में प्रोटीन की गतिविधि पर निर्भर फास्फारिलीकरण विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है. विशेष रूप से, वर्तमान प्रोटोकॉल तीव्र सीए 1 hippocampal स्लाइस, प्रेरण, और एलटीपी की रिकॉर्डिंग की तैयारी शामिल है. अगला, सीए 1 क्षेत्र microscopically प्रेरित क्षेत्र को अलग करने के विच्छेदित है. हम संयुक्त और झाओ और उनके सहयोगियों ने 17 से पेश परिवर्तन के साथ CellLytic परमाणु निकालना किट द्वारा प्रदान की जाने वाली परमाणु अलगाव के लिए प्रोटोकॉल संशोधित. अनुकूलित प्रक्रिया सेल सूजन और नाभिक की रिहाई की अनुमति hypotonic बफर में विच्छेदित सीए 1 क्षेत्रों की सेल भी शामिल है. सेल और नाभिक आकारिकी सूक्ष्म परीक्षण से निर्धारित किया जा सकता है. परमाणु संवर्धन एक छोटी centrifugation कदम से हासिल की है. NeuN और NSE2, परमाणु या साइटोसोलिक भिन्न की विशिष्ट मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ विश्लेषण Immunoblotting इस दृष्टिकोण एक उपवास के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि इंगित करता हैऔर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल इन subcellular भिन्न को अलग करने और प्रोटीन फास्फारिलीकरण की तरह बहुत अस्थिर posttranslational संशोधनों का अध्ययन करने के लिए. साथ ही, इस विधि हिप्पोकैम्पस स्लाइस की विच्छेदित सीए 1 क्षेत्रों से पाने छोटे ऊतकों के नमूनों के लिए फायदेमंद है और हिप्पोकैम्पस स्लाइस की immunohistochemistry के लिए संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों, हिप्पोकैम्पस तीव्र युवा या वयस्क चूहों से कटा हुआ तैयार टुकड़ा के उत्तेजित क्षेत्र को प्रेरित और रिकॉर्ड एलटीपी, तेजी से काटना, और गतिविधि निर्भर प्रोटीन गतिशीलता के अ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.
Materials
| Table 1. Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Axopatch 200B amplifier | Axon，USA | ||
| Axon Digidata acquisition system | Axon，USA | ||
| Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software | Axon，USA | ||
| Leica microscope | Leica TCS SP2，Germany | ||
| P-97 Standard microelectrode puller | Sutter，USA | ||
| Stereomicroscope | Leica | Leica S4E, Germany | |
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | Model2100, A-M systmes, USA | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17 | ||
| SDS-PAGE system | BIORAD | ||
| Cooler | JULABO | ||
| Bright field Microscope | NIKON ECLIPSE TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation, HERAEUS | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco | ||
| Cooler | Julabo, F12 | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17 | ||
| Submerged type Recording Chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Table 2. Reagents | |||
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| NaCl | ROTH | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| KCl | ROTH | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| CaCl2·2H2O | MERCK | 1.02382.0500 | pro analysi |
| MgSO4·2H2O | MERCK | 5886.05 | pro analysi |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for Molecularbiology |
| KH2PO4 | MERCK | 12034.025 | for Molecularbiology |
| Na2HPO4·2H2O | MERCK | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | ROTH | Art.-Nr.6887.1 | for Molecularbiology |
| Hepes | ROTH | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | MERCK | 1.06329.1000 | pro analysi |
| Protease inhibitor Coctail | ROCHE | ||
| Phosphostop | ROCHE | ||
| Bicuculline | Tocris bioscience | ||
| Isofluran | Baxter | ||
| Table 4. Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes/ purified | rabbit (dil. 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (dil. 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (dil. 1:1,000) |
| beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (dil. 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Species | ||
| IgG HRP Conjugated | DAKO | goat anti – mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP Conjugated | NEB | goat anti – rabbit (1:5,000) |
Referenzen
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