Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine Studieren
Summary
Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Induktion von Langzeit-Potenzierung in der CA1-Region des Hippocampus und der anschließenden Trennung der Kern angereicherten Fraktionen aus dem tetanized Bereich der Scheibe. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um abhängig Kernproteinimport in Zellmodellen von Lernen und Gedächtnis zu bestimmen Aktivität.
Abstract
Studium Aktivität abhängige Protein-Expression, subzelluläre Translokation oder Phosphorylierung ist unerlässlich, um die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen der synaptischen Plastizität zu verstehen. Langzeit-Potenzierung (LTP) und Langzeit-Depression (LTD) bei akuten Hippocampus induziert werden allgemein als Zellmodelle von Lernen und Gedächtnis akzeptiert. Es gibt zahlreiche Studien, die Live-Cell-Imaging oder Immunhistochemie Ansätze verwenden, um Aktivität abhängige Proteindynamik zu visualisieren. Diese Verfahren stützen sich auf die Eignung der Antikörper für Immunzytochemie oder Überexpression von Fluoreszenz-markierten Proteine in einzelnen Neuronen. Immunoblotting von Proteinen ist eine alternative Methode, die unabhängige Bestätigung der Ergebnisse. Die erste limitierende Faktor in der Vorbereitung subzellulärer Fraktionen aus einzelnen tetanized Hippocampus ist die geringe Menge an Material. Zweitens ist die Handhabung Verfahren entscheidend, weil auch sehr kurze und kleinere Manipulationen living Scheiben könnten Aktivierung bestimmter Signalkaskaden auslösen. Hier beschreiben wir einen optimierten Arbeitsablauf, um eine ausreichende Menge von Kern angereicherte Fraktion von ausreichender Reinheit aus der CA1-Region des Hippocampus akuten aus Rattenhirn erhalten. Als ein repräsentatives Beispiel gezeigt, dass die ERK1 / 2 phosphorylierte Form des synapto-Kernprotein Messenger Jacob aktiv transloziert in den Kern nach der Induktion von LTP und kann in einem Kern angereicherte Fraktion von CA1-Neuronen nachgewiesen werden.
Introduction
Synaptischen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDARs) spielen eine entscheidende Rolle bei der synaptischen Plastizität und Zellüberlebenssignalwohingegen die Aktivierung von extrasynaptischen NMDARs können Neurodegeneration und Zelltod auslösen. Diese Veränderungen hängen von streng kontrollierten / reglementierten Tätigkeit abhängige Genexpression und erfordern daher eine ständige Kommunikation zwischen aktivierten Synapsen oder Dendriten und den Zellkern 7. Die MAP-Kinasen ERK1 / 2 Effektoren der synaptischen NMDARs Signalisierung und in NMDAR-Aktivierungs-induzierte Genexpression beteiligt, während Signalisierung über extrasynaptischen NMDAR keine oder eine hemmende Wirkung auf ERK1 / 2 Aktivität 8,11.
Es gibt eine Reihe von Proteinen, die Shuttle zwischen dem distalen Dendriten und den Zellkern gezeigt wurden. Viele dieser Proteine enthalten ein Kernlokalisierungssignal und aktiv an Mikrotubuli in einer Dynein und Importin-abhängige Weise in den Zellkern transportiert 6,9. Interestingly, einige dieser Botenstoffe nur Transit an den Kern in Reaktion auf spezifische Stimuli synaptische. Beispielsweise retrograden Transport von cAMP response element binding protein 2 (CREB2) durch chemische LTD aber nicht LTP 12 induziert. Lokalisierten NMDAR-abhängige synaptische Stimulation treibt CREB-regulierten Transkriptions Coaktivator (CRTC1) in den Zellkern, einer Translokation, die in langfristigen hippocampalen Plastizität 4 beteiligt ist. Es wurde kürzlich gezeigt, dass das Protein Bote Jacob transloziert in den Zellkern, nachdem beide, synaptic und extrasynaptischen NMDAR-Aktivierung und regelt CREB abhängigen Gentranskription 5. Die synaptische oder extrasynaptischen Ursprung des Signals in einer posttranslationalen Modifikation von Jacob kodiert. Synaptische Aktivität induziert ERK1 / 2 abhängige Phosphorylierung von Jacob an einem entscheidenden Serin an Position 180 (pJacobS 180), die eine Voraussetzung für die anschließende Translokation in den Zellkern in der Grund Hippocampus Kultur ist. Außerdem habe ichn CA1 Neuronen des Hippocampus akuten pJacobS 180 transloziert in den Zellkern nach Schaffer Sicherheiten LTP aber nicht LTD 1,10. PS-180 Jacob führt zu einer erhöhten Expression von Genen Plastizität und das Gen-Expression zurückführt, die synaptische Funktion. In scharfem Kontrast dazu Jacob, die in den Zellkern transloziert nach extrasynaptischen NMDARs Aktivierung nicht an Ser180 phosphoryliert und kann mit verschiedenen Protein-Komplex in den Zellkern bewirkt in Verbindung gebracht werden "CREB abgeschaltet" und ein Zurückziehen der synaptischen Kontakte 10.
Die meisten veröffentlichten Studien über die Kernimport synapto-Kernprotein Messenger in dissoziierten neuronalen Primärkulturen durchgeführt worden. Daher wäre es interessant zu sehen, ob solche Erkenntnisse in physiologisch relevanter Bedingungen mit Hippocampus wiedergegeben werden, wo neuronale Konnektivität und Funktion sind viel besser erhalten. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Beurteilung der LTP-dependent nukleäre Translokation von Protein Boten durch Immunoblotting. Dieses Verfahren ist auch für die Analyse Aktivität abhängige Phosphorylierung von Proteinen in einer rohen Kernfraktion. Insbesondere beinhaltet das aktuelle Protokoll Vorbereitung der akuten CA1 des Hippocampus, Induktion, und die Aufnahme von LTP. Als nächstes wird CA1 Region mikroskopisch seziert, um den angeregten Bereich zu isolieren. Wir kombinierten und modifizierte das Protokoll für die Isolierung durch Atomkern CellLytic Extraction Kit mit Änderungen von Zhao und Kollegen 17 eingeführt wird. Das optimierte Verfahren umfasst die Lyse von seziert CA1 Regionen in hypotonischen Puffer ermöglicht Zellschwellung und die Freisetzung von Kernen. Zell-Lyse und Kerne Morphologie kann durch mikroskopische Untersuchung festgestellt werden. Urananreicherung wird durch einen kurzen Zentrifugationsschritt erzielt. Immunoblotting-Analyse mit Antikörpern gegen NeuN und NSE2, spezifische Marker für nukleare oder cytosolischen Fraktionen zeigt, dass dieser Ansatz als schneller eingesetzt werdenund reproduzierbare Protokoll, diese subzellulären Fraktionen zu isolieren und sehr labil posttranslationale Modifikationen wie Protein-Phosphorylierung zu studieren. Darüber hinaus ist dieses Verfahren für kleine Gewebeproben, die aus sezierten Bereiche CA1 des Hippocampus und kann vorteilhaft in Kombination Immunhistochemie von Schnitten des Hippocampus verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in der oben beschriebenen Protokoll Schritten eine Anleitung, wie die Vorbereitung von jungen Hippocampus akuten oder erwachsenen Ratten in Scheiben geschnitten, induzieren und Rekord LTP, schnell sezieren stimulierten Bereich der Scheibe, und bereiten Kern angereicherte Fraktion für das Studium Aktivität abhängige Proteindynamik. Dieser Ansatz ergibt sich aus Kombination von mehreren verschiedenen Methoden unabhängig voneinander verwendet. Wir optimierten Workflow und eine ausführlich genug für Anfänger, in …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.
Materials
| Table 1. Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Axopatch 200B amplifier | Axon，USA | ||
| Axon Digidata acquisition system | Axon，USA | ||
| Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software | Axon，USA | ||
| Leica microscope | Leica TCS SP2，Germany | ||
| P-97 Standard microelectrode puller | Sutter，USA | ||
| Stereomicroscope | Leica | Leica S4E, Germany | |
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | Model2100, A-M systmes, USA | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17 | ||
| SDS-PAGE system | BIORAD | ||
| Cooler | JULABO | ||
| Bright field Microscope | NIKON ECLIPSE TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation, HERAEUS | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco | ||
| Cooler | Julabo, F12 | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17 | ||
| Submerged type Recording Chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Table 2. Reagents | |||
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| NaCl | ROTH | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| KCl | ROTH | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| CaCl2·2H2O | MERCK | 1.02382.0500 | pro analysi |
| MgSO4·2H2O | MERCK | 5886.05 | pro analysi |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for Molecularbiology |
| KH2PO4 | MERCK | 12034.025 | for Molecularbiology |
| Na2HPO4·2H2O | MERCK | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | ROTH | Art.-Nr.6887.1 | for Molecularbiology |
| Hepes | ROTH | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | MERCK | 1.06329.1000 | pro analysi |
| Protease inhibitor Coctail | ROCHE | ||
| Phosphostop | ROCHE | ||
| Bicuculline | Tocris bioscience | ||
| Isofluran | Baxter | ||
| Table 4. Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes/ purified | rabbit (dil. 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (dil. 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (dil. 1:1,000) |
| beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (dil. 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Species | ||
| IgG HRP Conjugated | DAKO | goat anti – mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP Conjugated | NEB | goat anti – rabbit (1:5,000) |
Referenzen
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