Isolement de CA1 nucléaires enrichies fractions de coupes d'hippocampe pour étudier l'activité dépendante nucléaire importation de Synapto nucléaires protéines Messenger
Summary
Nous fournissons un protocole détaillé pour l'induction de la potentialisation à long terme dans la région CA1 de l'hippocampe et l'isolement subséquent de fractions enrichies à partir de la zone nucléaire tétanisée de la tranche. Cette approche peut être utilisée pour déterminer l'activité dépend énormément des importations de protéines nucléaires dans des modèles cellulaires de l'apprentissage et de la mémoire.
Abstract
Étude de l'expression de l'activité de la protéine dépendante, translocation subcellulaire, ou la phosphorylation est essentiel de comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents de la plasticité synaptique. Potentialisation à long terme (LTP) et la dépression à long terme (LTD) induite dans des coupes d'hippocampe aigus sont largement acceptés comme modèles cellulaires de l'apprentissage et de la mémoire. Il existe de nombreuses études qui utilisent l'imagerie cellulaire ou immunohistochimie approches vivantes de visualiser la dynamique des protéines dépendantes de l'activité. Cependant, ces méthodes reposent sur la pertinence d'anticorps pour immunocytochimie ou surexpression de protéines par fluorescence marqués dans les neurones simples. Immunoblotting des protéines est une méthode alternative fournissant une confirmation indépendante des résultats. Le premier facteur limitant dans la préparation de fractions subcellulaires de tranches d'hippocampe tétanisés individuelles est la faible quantité de matière. D'autre part, la procédure de traitement est cruciale, car même les manipulations très courtes et mineures de la vie des tranches peut induire l'activation de certaines cascades de signalisation. Nous décrivons ici un flux de travail optimisé afin d'obtenir une quantité suffisante de la fraction nucléaire enrichi d'une pureté suffisante de la région CA1 de l'hippocampe aiguës tranches de cerveau de rat. A titre d'exemple représentatif, nous montrons que la ERK1 / 2 sous forme phosphorylée de la protéine messager de synapto-Jacob translocation nucléaire activement au noyau lors de l'induction de la LTP et peut être détectée dans une fraction enrichie nucléaire de neurones CA1.
Introduction
Synaptic N-méthyl-D-aspartate-récepteurs (récepteurs NMDA) jouent un rôle crucial dans la plasticité synaptique et la survie des cellules de signalisation alors que l'activation des récepteurs NMDA extrasynaptiques peut déclencher la neurodégénérescence et la mort cellulaire. Ces variations dépendent de l'expression des gènes dépendant / d'activité régulée étroitement contrôlé et donc nécessitent une communication constante entre les synapses ou dendrites activées et le noyau 7. Le MAP kinases ERK1 / 2 sont des effecteurs en aval de récepteurs NMDA synaptiques de signalisation et sont impliqués dans l'expression des gènes NMDAR-activation induite, alors que la signalisation via NMDAR extrasynaptique n'a aucun effet ou un effet inhibiteur sur ERK1 / 2 activités 8,11.
Il existe un certain nombre de protéines qui ont été montrés pour faire la navette entre les dendrites distales et le noyau. Beaucoup de ces protéines contiennent un signal de localisation nucléaire et sont activement transportés le long de microtubules dans un dynéine et de manière dépendante importin au noyau 6,9. Interestingly, certains seulement de ces messagers transit vers le noyau en réponse à des stimuli spécifiques synaptiques. Par exemple, le transport rétrograde de cyclique élément de réponse AMP protéine de liaison à 2 (CREB2) est induite par LTD chimique mais non LTP 12. Localisée stimulation synaptique NMDAR dépendant entraîne co-activateur transcriptionnel CREB réglementés (CRTC1) dans le noyau, un processus de translocation, qui est impliquée dans la plasticité de l'hippocampe à long terme 4. Il a été récemment montré que le messager de la protéine Jacob translocation vers le noyau après l'autre, l'activation des récepteurs NMDA synaptiques et extrasynaptique et régule CREB gène transcription dépendante 5. L'origine synaptique ou extrasynaptique du signal est encodé dans une modification post-traductionnelle de Jacob. Activité synaptique induit ERK1 / 2 dépend de la phosphorylation de Jacob à une serine en position 180 cruciale (pJacobS 180) qui est une condition nécessaire pour la translocation vers le noyau ultérieur en culture primaire d'hippocampe. De plus, in neurones CA1 de 180 translocation de tranches d'hippocampe aigus vers le noyau après Schaffer garantie LTP mais pas LTD 1,10. PS180 Jacob conduit à une augmentation de l'expression des gènes de plasticité liée et cette expression de gène réinjecte de la fonction synaptique. À l'opposé, Jacob translocation vers le noyau après NMDARs extrasynaptiques activation n'est pas phosphorylée au niveau de Ser180 et peut être associé à différentes complexe protéique dans le noyau provoquant 'CREB arrêt' et une rétraction des contacts synaptiques 10.
La plupart des études publiées sur l'importation nucléaire de la protéine messager synapto-nucléaire ont été réalisées dans des cultures primaires de neurones dissociés. Par conséquent, il serait intéressant de voir si ces résultats peuvent être reproduits dans physiologiquement plus pertinent conditions en utilisant des coupes d'hippocampe où la connectivité et la fonction neuronale sont beaucoup mieux conservées. Nous présentons ici un protocole optimisé pour évaluer LTP-dependants translocation nucléaire de messagers de protéines par immuno. Ce procédé convient également pour l'analyse de l'activité de phosphorylation dépendant de protéines dans une fraction nucléaire brut. Plus précisément, le protocole actuel consiste à préparer des aigus tranches CA1 de l'hippocampe, de l'induction, et l'enregistrement de la LTP. Ensuite, région CA1 est disséqué au microscope à isoler la région stimulée. Nous avons combiné et modifié le protocole pour l'isolement nucléaire fourni par CellLytic nucléaire Extraction Kit avec modifications introduites par Zhao et ses collègues 17. La procédure optimisée comprend la lyse des régions CA1 disséqués dans un tampon hypotonique permettant gonflement des cellules et la libération des noyaux. La lyse des cellules et la morphologie des noyaux peuvent être déterminés par l'examen microscopique. Enrichissement nucléaire est réalisé par une étape de centrifugation de courte. Analyse immunoblot avec des anticorps contre NeuN et NSE2, les marqueurs spécifiques de fractions cytosoliques ou nucléaires, indique que cette approche peut être utilisée comme un jeûneet le protocole reproductible d'isoler ces fractions subcellulaires et d'étudier modifications post-traductionnelles très labiles comme la phosphorylation des protéines. En outre, ce procédé est avantageux pour de petits échantillons de tissus provenant des régions CA1 de tranches d'hippocampe disséqué et peut être utilisé en combinaison pour l'immunohistochimie de coupes d'hippocampe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes décrites dans le protocole ci-dessus fournissent des conseils comment préparer l'hippocampe aiguë tranches de rats, jeunes ou adultes, induire et enregistrer LTP, disséquer rapidement zone stimulée de tranche, et préparer fraction enrichie nucléaire pour l'étude de la dynamique des protéines dépendantes de l'activité. Cette approche découle de la combinaison de plusieurs méthodes utilisées indépendamment l'une de l'autre. Nous avons optimisé un flux de travail et de fourni…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.
Materials
| Table 1. Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Axopatch 200B amplifier | Axon，USA | ||
| Axon Digidata acquisition system | Axon，USA | ||
| Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software | Axon，USA | ||
| Leica microscope | Leica TCS SP2，Germany | ||
| P-97 Standard microelectrode puller | Sutter，USA | ||
| Stereomicroscope | Leica | Leica S4E, Germany | |
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | Model2100, A-M systmes, USA | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17 | ||
| SDS-PAGE system | BIORAD | ||
| Cooler | JULABO | ||
| Bright field Microscope | NIKON ECLIPSE TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation, HERAEUS | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco | ||
| Cooler | Julabo, F12 | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17 | ||
| Submerged type Recording Chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Table 2. Reagents | |||
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| NaCl | ROTH | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| KCl | ROTH | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| CaCl2·2H2O | MERCK | 1.02382.0500 | pro analysi |
| MgSO4·2H2O | MERCK | 5886.05 | pro analysi |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for Molecularbiology |
| KH2PO4 | MERCK | 12034.025 | for Molecularbiology |
| Na2HPO4·2H2O | MERCK | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | ROTH | Art.-Nr.6887.1 | for Molecularbiology |
| Hepes | ROTH | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | MERCK | 1.06329.1000 | pro analysi |
| Protease inhibitor Coctail | ROCHE | ||
| Phosphostop | ROCHE | ||
| Bicuculline | Tocris bioscience | ||
| Isofluran | Baxter | ||
| Table 4. Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes/ purified | rabbit (dil. 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (dil. 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (dil. 1:1,000) |
| beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (dil. 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Species | ||
| IgG HRP Conjugated | DAKO | goat anti – mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP Conjugated | NEB | goat anti – rabbit (1:5,000) |
Referenzen
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