Isolering af CA1 Nuclear berigede Fraktioner fra hippocampusskiver at studieaktivitet-afhængige kerneimport af Synapto-nukleare Messenger Proteiner
Summary
Vi giver en detaljeret protokol for induktion af langsigtede potensering i CA1-området i hippocampus og den efterfølgende isolering af nukleare berigede fraktioner fra tetanized område af skive. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at bestemme aktiviteten afhængig kerneprotein import i cellulære modeller for indlæring og hukommelse.
Abstract
Studer aktivitet afhængig proteinekspression subcellulær translokation eller phosphorylering er vigtigt at forstå de underliggende cellulære mekanismer af synaptisk plasticitet. Langsigtet (LTP) og på lang sigt depression (LTD) induceret i akutte hippocampusskiver er bredt accepteret som cellulære modeller for indlæring og hukommelse. Der er mange undersøgelser, der bruger levende celle billedbehandling eller immunhistokemi tilgange til at visualisere aktivitet afhængige protein dynamik. Men disse metoder er afhængige af egnetheden af antistoffer til immuncytokemi eller overekspression af fluorescens-mærkede proteiner i enkelte neuroner. Immunoblotting af proteiner er en alternativ metode yde uafhængig bekræftelse af resultaterne. Den første begrænsende faktor i fremstilling af subcellulære fraktioner fra individuelle tetanized hippocampusskiver er den lave mængde materiale. Andet behandlingsproceduren er afgørende, fordi selv meget korte og små manipulationer af living skiver kan fremkalde aktivering af visse signalleringskaskader. Her beskriver vi en optimeret arbejdsgang med henblik på at opnå en tilstrækkelig mængde nukleart fraktion af tilstrækkelig renhed fra CA1-regionen af akutte hippocampale skiver fra rottehjerne. Som et repræsentativt eksempel, viser vi, at ERK1 / 2 phosphorylerede form af synapto-kerneprotein messenger Jacob translokerer aktivt til kernen efter induktion af LTP og kan påvises i et nukleart fraktion fra CA1 neuroner.
Introduction
Synaptic N-methyl-D-aspartat-receptorer (NMDARs) spiller en afgørende rolle i synaptisk plasticitet og celle overlevelse signalering mens aktivering af ekstrasynaptiske NMDARs kan udløse neurodegeneration og celledød. Disse ændringer afhænger af stramt kontrolleret / reguleret aktivitet afhængig genekspression og derfor kræver konstant kommunikation mellem aktiverede synapser eller dendritter og kernen 7. MAP-kinaser ERK1 / 2 er downstream effektorer af synaptiske NMDARs signalering og er involveret i NMDAR-aktiverings-induceret genekspression, mens signalering via ekstrasynaptiske NMDAR har ingen eller en hæmmende virkning på ERK1 / 2-aktivitet 8,11.
Der er antallet af proteiner, som har vist sig at shuttle mellem distale dendritter og kernen. Mange af disse proteiner indeholder kernelokaliseringssignalet og aktivt transporteres langs mikrotubuli i en dynein og importin-afhængig måde til kernen 6,9. Interestingly, nogle af disse budbringere kun transit til kernen som svar på specifikke synaptiske stimuli. For eksempel er retrograd transport af cyklisk AMP-responselement bindingsprotein 2 (CREB2) induceret ved kemisk LTD men ikke LTP 12. Lokaliseret NMDAR-afhængige synaptisk stimulering driver CREB-reguleret transkriptionel coaktivator (CRTC1) ind i kernen, en translokation proces, som er involveret i en langsigtet hippocampus plasticitet 4. Det blev for nyligt vist, at proteinet messenger Jakob translokerer til kernen efter både synaptisk og ekstrasynaptiske NMDAR aktivering og regulerer CREB afhængig gentranskription 5. Synaptic eller ekstrasynaptiske oprindelse af signalet er kodet i en posttranslationel modifikation af Jakob. Synaptisk aktivitet inducerer ERK1 / 2 afhængig phosphorylering af Jacob på et afgørende serin ved position 180 (pJacobS 180), som er en forudsætning for den efterfølgende translokation til kernen i den primære hippocampus kultur. Derudover er jegn CA1 neuroner i akutte hippocampale skiver pJacobS 180 translokerer til kernen efter Schaffer sikkerhed LTP men ikke LTD 1,10. pS180 Jacob fører til en forøget ekspression af plasticitet gener og denne genekspression feeds tilbage til synaptisk funktion. I skarp kontrast Jacob der translokerer til kernen efter ekstrasynaptiske NMDARs aktivering ikke er phosphoryleret ved Ser180 og kan være forbundet med forskellige protein-kompleks i kernen forårsager "CREB slukket" og en tilbagetrækning af synaptiske kontakter 10.
Mest offentliggjorte undersøgelser om det nukleare import af synapto-kerneprotein messenger have været gjort i dissocierede neuronale primære kulturer. Derfor vil det være interessant at se, om sådanne fund kan gengives i fysiologisk mere relevant forhold og anvendelse hippocampusskiver hvor neuronal tilslutningsmuligheder og funktion er meget bedre bevaret. Her præsenterer vi en optimeret protokol til vurdering af LTP-degige kernetranslokation af protein budbringere ved immunblotting. Denne metode er også egnet til at analysere aktivitet afhængig phosphorylering af proteiner i en rå nukleare fraktion. Specifikt den nuværende protokol indebærer udarbejdelse af akutte CA1 hippocampus skiver, induktion og registrering af LTP. Dernæst CA1 region mikroskopisk dissekeret for at isolere det stimulerede område. Vi kombineres og modificeres protokollen for nuklear isolation fra CellLytic Nuclear Extraction Kit med ændringer af Zhao og hans kolleger 17. Den optimerede procedure omfatter lyse af dissekerede CA1- regioner i hypotonisk buffer tillader celle hævelse og frigivelse af kerner. Cellelyse og kerner morfologi kan bestemmes ved mikroskopisk undersøgelse. Nuklear berigelse opnås ved en kort centrifugering. Immunblotting analyse med antistoffer mod Neun og NSE2 specifikke markører for nukleare eller cytosoliske fraktioner viser, at denne fremgangsmåde kan anvendes som en hurtigog reproducerbar protokol til at isolere disse subcellulære fraktioner og til at studere meget labile posttranslationelle modifikationer som proteinphosphorylering. Desuden er denne metode fordelagtigt for små vævsprøver stammer fra dissekerede CA1 regioner hippocampusskiver og kan anvendes i kombination til immunohistokemi hippocampusskiver.
Protocol
Representative Results
Discussion
De er beskrevet i ovennævnte protokol trin giver vejledning, hvordan man forbereder hippocampus akut skåret fra unge eller voksne rotter, fremkalde og optage LTP, hurtigt dissekere stimuleret område skive, og forberede nukleare fraktion for at studere aktivitet afhængige protein dynamik. Denne fremgangsmåde stammer fra en kombination af flere forskellige metoder, der anvendes uafhængigt af hinanden. Vi optimeret et workflow og giver tilstrækkelig detaljeret for begynderen at oprette deres egne eksperimenter til a…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.
Materials
| Table 1. Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Axopatch 200B amplifier | Axon，USA | ||
| Axon Digidata acquisition system | Axon，USA | ||
| Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software | Axon，USA | ||
| Leica microscope | Leica TCS SP2，Germany | ||
| P-97 Standard microelectrode puller | Sutter，USA | ||
| Stereomicroscope | Leica | Leica S4E, Germany | |
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | Model2100, A-M systmes, USA | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17 | ||
| SDS-PAGE system | BIORAD | ||
| Cooler | JULABO | ||
| Bright field Microscope | NIKON ECLIPSE TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation, HERAEUS | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco | ||
| Cooler | Julabo, F12 | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17 | ||
| Submerged type Recording Chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Table 2. Reagents | |||
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| NaCl | ROTH | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| KCl | ROTH | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| CaCl2·2H2O | MERCK | 1.02382.0500 | pro analysi |
| MgSO4·2H2O | MERCK | 5886.05 | pro analysi |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for Molecularbiology |
| KH2PO4 | MERCK | 12034.025 | for Molecularbiology |
| Na2HPO4·2H2O | MERCK | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | ROTH | Art.-Nr.6887.1 | for Molecularbiology |
| Hepes | ROTH | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | MERCK | 1.06329.1000 | pro analysi |
| Protease inhibitor Coctail | ROCHE | ||
| Phosphostop | ROCHE | ||
| Bicuculline | Tocris bioscience | ||
| Isofluran | Baxter | ||
| Table 4. Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes/ purified | rabbit (dil. 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (dil. 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (dil. 1:1,000) |
| beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (dil. 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Species | ||
| IgG HRP Conjugated | DAKO | goat anti – mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP Conjugated | NEB | goat anti – rabbit (1:5,000) |
Referenzen
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neurowissenschaften. 169 (4), 1520-1526 (2010).
- Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
- Ch’ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O’Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
- Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
- Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again–communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
- Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
- Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
- Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
- Lai, K. O., Zhao, Y., Ch’ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neurowissenschaften. 131 (3), 601-610 (2005).
- Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
- Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
- Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).
