عزل CA1 النووي المخصب الكسور من شرائح الحصين لدراسة تعتمد على نشاط استيراد النووية من رسول البروتينات Synapto النووية
Summary
نحن نقدم بروتوكول مفصلة لتحريض التقوية على المدى الطويل في المنطقة CA1 من الحصين والعزلة اللاحقة الكسور التخصيب النووية من منطقة tetanized للشريحة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد النشاط يعتمد استيراد البروتين النووي في النماذج الخلوية التعلم والذاكرة.
Abstract
دراسة نشاط البروتين يعتمد التعبير، إزفاء التحت خلوية، أو الفسفرة ضروري لفهم الآليات الخلوية الكامنة وراء اللدونة متشابك. تحظى بقبول واسع التقوية طويلة الأمد (LTP) والاكتئاب الطويل الأمد (LTD) المستحثة في شرائح الحصين الحادة كنماذج الخلوية التعلم والذاكرة. هناك العديد من الدراسات التي تستخدم التصوير الخلية المناعية أو النهج الحية لتصور النشاط ديناميات البروتين تعتمد. لكن هذه الطرق تعتمد على مدى ملاءمة الأجسام المضادة للمناعية أو overexpression من البروتينات الموسومة مضان في الخلايا العصبية واحدة. Immunoblotting من البروتينات هو طريقة بديلة توفير تأكيد مستقل للنتائج. العامل المحدد الأول في إعداد الكسور التحت خلوية من شرائح قرن آمون tetanized الفردية هو كمية قليلة من المواد. ثانيا، إجراء معالجة أمر بالغ الأهمية لأن التلاعب حتى قصيرة جدا وبسيطة للترتعيشان شرائح قد تتسبب في تنشيط بعض أجهزة الطرد المركزي الإشارات. نحن هنا وصف لسير العمل الأمثل من أجل الحصول على كمية كافية من نسبة التخصيب النووي من النقاء ما يكفي من المنطقة CA1 من شرائح الحصين الحادة من دماغ الفئران. كمثال التمثيلي وتبين لنا أن شكل فسفرته للsynapto النووي البروتين رسول ERK1 / 2 يعقوب translocates بنشاط إلى النواة على تحريض LTP ويمكن الكشف في جزء التخصيب النووي من الخلايا العصبية CA1.
Introduction
متشابك N-ميثيل مد اسبارتاتي مستقبلات (NMDARs) تلعب دورا حاسما في اللدونة متشابك وبقاء الخلية إشارات حين تفعيل NMDARs extrasynaptic يمكن أن تؤدي إلى تنكس عصبي وموت الخلايا. هذه التغيرات تعتمد على / النشاط المنظم لرقابة مشددة التعبير الجيني يتوقف وبالتالي تتطلب التواصل المستمر بين نقاط الاشتباك العصبي أو التشعبات وتنشيط نواة 7. خطة عمل البحر المتوسط تحركات ERK1 / 2 هي المستجيبات المصب من NMDARs متشابك الإشارات ويشاركون في NMDAR-يسببها تفعيل التعبير الجيني، في حين يشير عبر NMDAR extrasynaptic لا يوجد لديه أو لها تأثير كابح بشكل خاص على ERK1 / 2 النشاط 8،11.
هناك عدد من البروتينات التي ثبت أنها مكوكية بين التشعبات القاصي والنواة. العديد من هذه البروتينات تحتوي على إشارة توطين النووية ويتم نقلها بنشاط على طول microtubuli في داينين وبطريقة تعتمد على importin إلى النواة 6،9. Interestinglذ، بعض هذه رسل عبور فقط إلى النواة في الاستجابة للمؤثرات متشابك محددة. على سبيل المثال، التي يسببها النقل الوراء من دوري AMP عنصر استجابة ملزمة البروتين 2 (CREB2) من خلال LTD الكيميائي ولكن ليس LTP 12. المحلية التي تعتمد على التحفيز NMDAR متشابك يقود التنظيم CREB coactivator النسخي (CRTC1) في النواة، وهي عملية النبات، التي تشارك في اللدونة الحصين على المدى الطويل 4. وقد تبين مؤخرا أن رسول البروتين يعقوب translocates إلى النواة بعد كل وتفعيل NMDAR متشابك وextrasynaptic وينظم CREB النسخ الجيني يعتمد 5. يتم ترميز أصل متشابك أو extrasynaptic للإشارة إلى تعديل ما بعد النقل يعقوب. النشاط متشابك يدفع ERK1 / 2 الفسفرة تعتمد يعقوب في سيرين حاسمة في الموقف 180 (pJacobS 180) الذي هو شرط مسبق لاحق إزفاء إلى النواة في الثقافة الحصين الابتدائية. وعلاوة على ذلك، طن الخلايا العصبية CA1 من شرائح الحصين الحادة pJacobS 180 translocates إلى النواة بعد شافر ضمانات LTP لكن ليس LTD 1،10. pS180 يعقوب يؤدي إلى زيادة التعبير عن الجينات المرتبطة اللدونة وهذا التعبير الجيني يغذي العودة إلى وظيفة متشابك. في تناقض حاد، يعقوب أن translocates إلى النواة بعد لم يتم تفعيل فسفرته NMDARs extrasynaptic في Ser180 و قد تترافق مع مجمع بروتين مختلفة في النواة مما تسبب في "CREB ايقافها" وتراجع من الاتصالات متشابك 10.
أجريت معظم الدراسات المنشورة على استيراد النووي-synapto النووي البروتين رسول في الثقافات الأولية العصبية فصلها. لذا سيكون من المثير للاهتمام أن نرى ما اذا كان يمكن تكرار هذه النتائج في أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية الظروف باستخدام شرائح قرن آمون حيث الربط وظيفة الخلايا العصبية هي أفضل بكثير الحفاظ عليها. هنا نقدم بروتوكول الأمثل لتقييم LTP-ديمعلقة النبات النووي من رسل البروتين immunoblotting. هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة لتحليل النشاط الفسفرة تعتمد البروتينات في جزء نووي بدائي. على وجه التحديد، والبروتوكول الحالي يتضمن إعداد الحادة شرائح CA1 الحصين، التعريفي، وتسجيل LTP. بعد ذلك، يتم تشريح المنطقة CA1 مجهريا لعزل المنطقة حفز. ونحن معا وتعديل البروتوكول لعزل النووية التي تقدمها CellLytic النووية استخراج كيت مع التغييرات التي أدخلها تشاو وزملاؤه 17. ويشمل الإجراء الأمثل تحلل من المناطق CA1 تشريح في المخزن منخفض التوتر السماح تورم الخلية وإطلاق نوى. يمكن تحديد تحلل الخلايا وأنويتها مورفولوجيا عن طريق الفحص المجهري. ويتحقق تخصيب اليورانيوم بواسطة الطرد المركزي خطوة قصيرة. Immunoblotting مع تحليل الأجسام المضادة ضد NeuN وNSE2، وعلامات محددة من الكسور النووية أو عصاري خلوي، يشير إلى أن هذا النهج يمكن أن تستخدم بسرعةوبروتوكول استنساخه لعزل هذه الكسور التحت خلوية ودراسة تعديلات ما بعد النقل عطوب جدا مثل البروتين الفسفرة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هو مفيد للعينات الأنسجة الصغيرة المستمدة من مناطق CA1 تشريح شرائح قرن آمون، ويمكن استخدامها في تركيبة لالمناعية من شرائح قرن آمون.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات المذكورة في البروتوكول فوق إرشادات كيفية تحضير شرائح الحصين الحادة من الشباب أو الكبار الفئران، لحث وسجل LTP، تشريح بسرعة منطقة حفز شريحة، وإعداد جزء التخصيب النووي لدراسة نشاط ديناميات البروتين تعتمد. هذا النهج مستمد من مزيج من عدة أساليب مختلفة تستخدم بشكل…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.
Materials
| Table 1. Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Axopatch 200B amplifier | Axon，USA | ||
| Axon Digidata acquisition system | Axon，USA | ||
| Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software | Axon，USA | ||
| Leica microscope | Leica TCS SP2，Germany | ||
| P-97 Standard microelectrode puller | Sutter，USA | ||
| Stereomicroscope | Leica | Leica S4E, Germany | |
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | Model2100, A-M systmes, USA | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17 | ||
| SDS-PAGE system | BIORAD | ||
| Cooler | JULABO | ||
| Bright field Microscope | NIKON ECLIPSE TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation, HERAEUS | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco | ||
| Cooler | Julabo, F12 | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17 | ||
| Submerged type Recording Chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Table 2. Reagents | |||
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| NaCl | ROTH | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| KCl | ROTH | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| CaCl2·2H2O | MERCK | 1.02382.0500 | pro analysi |
| MgSO4·2H2O | MERCK | 5886.05 | pro analysi |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for Molecularbiology |
| KH2PO4 | MERCK | 12034.025 | for Molecularbiology |
| Na2HPO4·2H2O | MERCK | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | ROTH | Art.-Nr.6887.1 | for Molecularbiology |
| Hepes | ROTH | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | MERCK | 1.06329.1000 | pro analysi |
| Protease inhibitor Coctail | ROCHE | ||
| Phosphostop | ROCHE | ||
| Bicuculline | Tocris bioscience | ||
| Isofluran | Baxter | ||
| Table 4. Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes/ purified | rabbit (dil. 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (dil. 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (dil. 1:1,000) |
| beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (dil. 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Species | ||
| IgG HRP Conjugated | DAKO | goat anti – mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP Conjugated | NEB | goat anti – rabbit (1:5,000) |
Referenzen
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neurowissenschaften. 169 (4), 1520-1526 (2010).
- Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
- Ch’ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O’Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
- Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
- Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again–communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
- Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
- Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
- Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
- Lai, K. O., Zhao, Y., Ch’ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neurowissenschaften. 131 (3), 601-610 (2005).
- Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
- Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
- Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).
