وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية
Summary
هنا نحن تصف طرق بسيطة لإعداد الحويصلات، والتغليف من النسخ وآلات الترجمة، ورصد إنتاج البروتين. نظم خالية من الخلايا الناتجة يمكن استخدامها كنقطة انطلاق من خلالها لبناء يقلد الخلوية تزداد تعقيدا.
Abstract
كما التحولات الفائدة من الجزيئات الفردية لأنظمة الجزيئات، وقد سعى عدد متزايد من مختبرات لبناء من أسفل إلى أعلى يقلد الخلوية التي تمثل أفضل تعقيد الحياة الخلوية. حتى الآن هناك عددا من المسارات التي يمكن اتخاذها لبناء يقلد الخلوية مجزأة، بما في ذلك استغلال مستحلبات الماء في الزيت، وأجهزة ميكروفلويديك، والحويصلات. كل واحد من الخيارات المتاحة لديها مزايا وعيوب محددة. على سبيل المثال، مستحلبات الماء في الزيت تعطي كفاءة عالية التغليف ولكن لا تحاكي جيدا حاجز نفاذية الخلايا الحية. الميزة الأساسية من الطرق الموصوفة هنا هو أنها كلها سهلة ورخيصة لتنفيذ. يتم تغليف آلات النسخ الترجمة داخل الحويصلات فوسفورية خلال العملية التي تستغل الأجهزة المشتركة، مثل المبخر الطرد المركزي والطارد. ويتم رصد ردود الفعل من قبل مضان الطيفي. بروتوكولو يمكن تكييفها لالمؤتلف تعبير البروتين، وبناء يحاكي الخلوية، واستكشاف متطلبات الحد الأدنى للحياة الخلوية، أو الجمعية من الدوائر الجينية.
Introduction
خالية من الخلايا، في المختبر التفاعلات النسخ الترجمة وتوليد الحويصلات من الدهون الاصطناعية ليست شيئا جديدا. ومع ذلك، والجمع بين اثنين الى الخلوية تقليد هو أكثر بكثير challenging1-6. E. مقتطفات الخلية القولونية مع أو بدون T7 RNA البلمرة يمكن استخدامها كمصدر للآلات النسخ، ترجمة 7،8. فائدة مقتطفات خلية من وجود المكونات الخلوية الإضافية التي يمكن أن تسهل تعبير البروتين وقابلة للطي. بدلا من ذلك، مزيج من حدة تنقية الحمض النووي الريبي وجزيئات البروتين، أي نظام PURE 9، ويمكن استخدامها للتوسط intravesicular تخليق البروتين 4،10-14. نظام PURE يسمح لبناء يقلد الخلوية محددة تماما ولا يعاني من النشاط نوكلياز وجدت في مقتطفات الخلية. عمليا، هذا يعني أنه مطلوب قالب الحمض النووي أقل من ذلك بكثير، مما يسهل عمليات مع انخفاض كفاءة التغليف 11 </sup>. وإن كانت أقل استخداما، ويمكن أن يبنى يقلد الخلوية مع مقتطفات الخلية المستمدة من cells15 حقيقية النواة. حتى الآن، تم الإبلاغ عن شلالات مغلفة المشفرة وراثيا ويقلد الخلوية التي الإحساس بالبيئة 16-18.
إن أبسط طريقة لرصد ردود الفعل النسخ الترجمة هو قياس مضان أو التلألؤ من عناصر المشفرة وراثيا. عادة، luciferase يراعة 19 أو GFP تستخدم، على الرغم من أن في المختبر غالبا ما تقاس ردود الفعل من قبل radiolabeling. الكشف عن مضان يسمح أيضا لرصد السكان من الحويصلات 20،21 من خلال الطرق المعتمدة على الخلوي، مما يوفر بعض التبصر في طبيعة العشوائية من العمليات البيولوجية مثل. وقد استخدمت هذه الأساليب الرصد لتحديد مجموعة صغيرة من قواعد التصميم ومكتبة من أجزاء من خلالها بناء من، بما في ذلك مجموعة من البروتينات الفلورية التي تتوافق مع طن النسخ المختبر الترجمة 22، وتأثير منظمة الجيني على التعبير 22، النشاط من العوامل سيجما 16، وكفاءة الإنهاء النسخي 23. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير الذي يتعين القيام به لزيادة القدرة على بناء يمكن التنبؤ بها في المختبر والأجهزة المشفرة وراثيا.
هناك العديد من الأساليب المتاحة لجعل الحويصلات. الأساليب الأكثر شيوعا تعتمد على جيل من فيلم الدهون رقيقة على سطح الزجاج تليها إعادة تعليق في solution24 مائي. إذا كان محلول مائي يحتوي على آلات النسخ، الترجمة، على سبيل المثال، ثم جزء من الحويصلات شكلت شأنه أن يحتوي على العناصر اللازمة لإنتاج البروتين. ومع ذلك، فإن كفاءة التغليف من هذه الأساليب هو منخفض، وهذا يعني أنه ليس هناك سوى نسبة ضئيلة من الحويصلات نشطة. العديد من الطرق البديلة التي تتسم أعلى من ذلك بكثير EFF التغليفiciency استغلال التحويل من قطرات الماء في مستحلب النفطية إلى حويصلات. في حين أنه من المرجح أن مثل هذه الأساليب سوف تكون أمرا شائعا في المستقبل، في الوقت الراهن هذه الأساليب يعانون من الحاجة إلى المعدات المتخصصة وإعطاء الحويصلات مع التراكيب غشاء تتغير 25. ميزة واضحة من المياه في النفط إلى أساليب حويصلة هو القدرة على السيطرة lamellarity الغشاء. وتستند هذه الطريقة الموصوفة هنا على بروتوكول فيلم الدهون رقيقة وصفها من قبل المختبر Yomo 11 مع تعديلات طفيفة بما في ذلك خطوة التجانس إضافية. هذه الطريقة سهلة ورخيصة، ويعطي الحويصلات قوية مناسبة تماما لتغليف آلات النسخ، الترجمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن البيولوجيا الاصطناعية خالية من الخلايا لا يزال في مراحله الأولى، قد وضعت أساسا من التقدم الذي نظم مثل الخلية التي تزداد تعقيدا ويمكن إجراء. كان إعادة تشكيل آلات النسخ، الترجمة من يعرف تماما مكونات 9 داخل الحويصلات 28 أهمية خاصة في تسهيل جهود لاحقا في بناء اصطناعية تستجيب للبيئة cells17، 18. وبالمثل، وقد استخدمت دراسات الخلية الاصطناعية لبحث العمليات التطورية 4،29،30، وتفاصيل الآلية من RNA وتخليق البروتين 22،31، وتأثيرات أيضية load32، 33، والجمعية من الجسيمات الفيروسية 34. الأهم من ذلك، ما يكفي من المعرفة موجود الآن يمكن أن يعاد تشكيل تلك الوظيفة الخلوية الأساسية داخل الحويصلات في المختبر بعد هذه التقارير السابقة والبروتوكولات المذكورة في هذه الوثيقة.
بالإضافة إلى كونه سهل، والتغليف وصفها العلاقات العامةocedure له فوائد عدة. على سبيل المثال، يمكن إجراء العديد من فارغة، مأخوذة حويصلة مجفف بالتجميد في وقت مبكر وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. بروتوكول يفعل الجزيئات البيولوجية لا تخضع للمذيبات العضوية، والتغيرات في درجات الحرارة جذرية، أو فترات طويلة من غسيل الكلى. ونحن نتوقع أن دماثة الإجراء سيسهل دمج مكونات إضافية حسب الحاجة. ونحن أيضا لم يلاحظ الآثار السلبية لتغير تكوين الدهون في غشاء على التغليف أو كفاءة النسخ الترجمة. ولذلك، والدهون أكثر استعدادا لإدراج بروتينات الغشاء، الأشكال التضاريسية محددة، أو التصور يمكن تصور أن تستغل.
فإن القيود الرئيسية من الطريقة الموضحة هو أن الحويصلات الناتجة ليست متجانسة في الحجم أو lamellarity. للعديد من التطبيقات، هذه الصعوبات لا تتعارض مع تفسير البيانات. ومع ذلك، إذا لزم الأمر، ويمكن إدراج خطوات إضافية لال ضيقتوزيع حجم البريد وتقلل من طبقات من الأغشية، مثل جولات أخرى من قذف بعد التغليف، وتجميد ذوبان الجليد، أو غسيل الكلى 35. وسيتم تطوير طرق أفضل مما لا شك فيه أن الالتفاف على هذه المشاكل وغيرها. حتى ذلك الحين، نجد بروتوكول الموصوفة هنا لتكون مناسبة تماما لبناء يقلد الخلوية.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نعترف مؤسسة Armenise-هارفارد، وماري كوري ترينتينو COFUND (ACS)، المقاطعة المتمتعة بالحكم الذاتي من ترينتو (Ecomm)، وCIBIO للحصول على التمويل.
Materials
| Quick Spin Mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Spectrometer | NanoDrop 1000 | NDB767ND | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 770557 | MW 760 g/mol Transition Temp -2 °C CAS# 26853-31-6 |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 459836 | Anhydrous, >99.5% |
| Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use | Sigma Aldrich | P3803-100mL | Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA |
| Chloroform | Biotech Grade Fluka | 496189-1L | Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer |
| Brown amber glass bottles | VWR | 89043-518 | 55X 48 mm |
| Rotary evaporator | Buchi Rotovapor R-210/Sigma | Z563846EU-1EA | With jack and water bath, 29/32 joint 240 V |
| Analog vortex mixer | VWR | 945300 | Speed 1,000-3,200 rpm |
| Homogenizer | IKA T10 Basic Ultra-Turbax | 3420000 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610020 | |
| Extruder filters | Whatman | 610014 | drain disc 10 mm |
| Extruder polycarbonate membrane 400 nm | Whatman | 61007 | nuclepore polycarbonate |
| Speed vacuum | Labconco | 7970011 | Centritrap DNA concentrator |
| PURExpress kit | New England Biolabs | NRM #E6800S | |
| RNAse inhibitor (40,000 U/ml) | New England Biolabs | #M0307S | |
| Proteinase K (20.2 mg/ml) | Fermentas | #EO0491 | |
| Microscope | Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera | ||
| RealTime | CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad) | ||
| Silicon press to seal -Molecular Probe | Life Technologies | P18174 | Resistant from -25-30 °C |
| Siliconized glass circle cover slides | Hampton Research | HR3-231 | Diameter= 22 mm |
| ImageJ | NIH |
Referenzen
- Forster, A. C., Church, G. M. Towards synthesis of a minimal cell. Mol. Syst. Biol. 2, 1-10 (2006).
- Noireaux, V., Maeda, Y. T., Libchaber, A. Development of an artificial cell, from self-organization to computation and self-reproduction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3473-3480 (2011).
- Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: Exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Curr. Opin. Biotech. 23, (2012).
- Nishikawa, T., Sunami, T., Matsuura, T., Yomo, T. Directed Evolution of Proteins through In Vitro Protein Synthesis in Liposomes. J. Nucleic Acids. 2012, 1-11 (2012).
- Forlin, M., Lentini, R., Mansy, S. S. Cellular imitations. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 586-592 (2012).
- Chiarabelli, C., Stano, P., Anella, F., Carrara, P., Luisi, P. L. Approaches to chemical synthetic biology. FEBS Lett. 586, 2138-2145 (2012).
- Noireaux, V., Shin, J. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 1-9 (2010).
- Fujiwara, K., Nomura, S. -. i. M. Condensation of an Additive-Free Cell Extract to Mimic the Conditions of Live Cells. PLoS ONE. 8, e54155 (2013).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).
- Hosoda, K., et al. Quantitative Study of the Structure of Multilamellar Giant Liposomes As a Container of Protein Synthesis Reaction. Langmuir. 24, 13540-13548 (2008).
- Sunami, T., Matsuura, T., Suzuki, H., Yomo, T. Synthesis of Functional Protiens Within Liposomes. Methods Mol. Biol. 607, 243-256 (2010).
- Murtas, G., Kuruma, Y., Bianchini, P., Diaspro, A., Luisi, P. L. Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 12-17 (2007).
- Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. The Minimal Size of Liposome-Based Model Cells Brings about a Remarkably Enhanced Entrapment and Protein Synthesis. ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).
- Caschera, F., et al. Programmed Vesicle Fusion Triggers Gene Expression. Langmuir. 27, 13082-13090 (2011).
- Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Godefroy, J., Salman, H., Libchaber, A. Toward an artificial cell based on gene expression in vesicles. Phys. Biol. 2, P1-P8 (2005).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synth. Biol. 1, 29-41 (2012).
- Kobori, S., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Yomo, T. A controllable gene expression system in liposomes that includes a postive feedback loop. Mol. Syst. Biol. 9, 1282-1285 (2013).
- Martini, L., Mansy, S. S. Cell-like Systems with Riboswitch Controlled Gene Expression. Chem. Commun. 47, 10734-10736 (2011).
- Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12672-12677 (2003).
- Sunami, T., et al. Detection of Association and Fusion of Giant Vesicles Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter. Langmuir. 26, 15098-15103 (2010).
- Saito, H., et al. Time-Resolved Tracking of a Minimum Gene Expression System Reconstituted in Giant Liposomes. ChemBioChem. 10, 1640-1643 (2009).
- Lentini, R., et al. Fluorescent Proteins and in Vitro Genetic Organization for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. , (2013).
- Du, L., Villarreal, S., Forster, A. C. Multigene Expression In Vivo: Supremacy of Large Versus Small Terminators for T7 RNA Polymerase. Biotechnol. Bioeng. 109, 1043-1050 (2011).
- Trochilin, V. P., Weissig, V. . Liposomes: A Practical Approach. , (2003).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning. , (2001).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17669-17674 (2004).
- Yu, W., et al. Synthesis of Functional Protein in Liposome. J. Biosci. Bioeng. 92, 590-593 (2001).
- Caschera, F., et al. Stable vesicles composed of monocarboxylic or dicarboxylic fatty acids and trimethylammonium amphiphiles. Langmuir. 27, 14078-14090 (2011).
- Pereira de Souza, T., Steiniger, F., Stano, P., Fahr, A., Luisi, P. L. Spontaneous crowding of ribosomes and proteins inside vesicles: a possible mechanism for the origin of cell metabolism. ChemBioChem. 12, 2325-2330 (2011).
- Niederholtmeyer, H., Xu, L., Maerkl, S. J. Real-Time mRNA Measurement during an in Vitro Transcription and Translation Reaction Using Binary Probes. ACS Synth. Biol. 10, (2012).
- Stögbauer, T., Windhager, L., Zimmer, R., Rädler, J. Experiment and mathematical modeling of gene expression dynamics in a cell-free system. Integr. Biol. 4, 494-501 (2012).
- Lazzerini-Ospri, L., Stano, P., Luisi, P., Marangoni, R. Characterization of the emergent properties of a synthetic quasi-cellular system. BMC Bioinformatics. 13, 1-10 (2011).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synth. Biol. 1, 408-413 (2012).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of Large Monodisperse Vesicles. PLoS ONE. 4, 1-4 (2009).
