設定アップ<em>体外</emラット血液脳関門の>モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

生産·プロトコル の多孔度を有するフィルター上で（a）の微小血管からの内皮細胞の精製、（b）の増殖、および（c）分化（12ウェルポリエチレンプレート：プロトコルは、培養培地組成の大きな変化に対応する3つの段階に分けることができるアストロサイトとの共培養中の1程度）。製造プロトコルの異なるステップは、一次細胞培養物（ 図1）の再現性を高めるために、特定の曜日に割り当てた。最初の週の水曜日に、それゆえ9日共培養系の確立の前に、微小血管は、（ 図2A）を単離した。内皮細胞を精製するために、培養液を5日間ピューロマイシンの濃度を減少させるの存在下で維持した。ほとんどの混入細胞（主に周皮細胞）を排除し、内皮細胞の増殖は、それらの表現型を変更することなく遅かったした。スピンドルShaped細胞はラットの脳の灰白質（ 図2B）から分離され、毛細管の断片から成長。第二週の月曜日に、ラットのアストロサイトは、12ウェルプレートの底に播種した。年RBEC、フィルタの管腔コンパートメントに添加した。 160×10 3細胞/ cm 2（ 図2C）での高密度播種は、フィルタ（ 図2D）の周囲に隙間を回避するのに役立ち、内皮細胞単層の均質な分化を生成する。細胞は、長手方向に整列する、典型的な細長い紡錘状の形態を示し、均一な単層を形成する。木曜日、星状細胞培養培地は、前の共培養培地（ 図2E）でコンディショニング分化培地に変更した。金曜日RBECはフィルター上に500 nMのヒドロコルチゾンを含む培地で増殖させ、フィルタが星状細胞を含む12ウェルプレートに移した。第三週に、実験WERE月曜日と水曜日の間で行われる。 RBECキャラ単層浸透性の決定要素 RBECは、内皮てBBBマーカーの免疫染色によってだけでなく、TEER、LYの透過性や、P-gpのような排出トランスポーターの機能の測定によって特徴付けられた。 RBECピューロ精製法によって得られた（ 図1及び2）の合流で成長阻害を示し、しっかりと並置、紡錘状や紡錘型の形態を示し、重複しない連続単層に成長した。 RBEC培養は、内皮細胞の典型的なマーカーを発現した：それらは、血小板内皮細胞接着分子（ 図3A; CD31/PECAM）について陽性の免疫染色を示し、フォン·ヴィレブランド因子（ 図3B）の発現。ピューロ処理なし、RBECs素早くデスミン免疫染色で検出された周皮細胞に侵略されるtaining（ 図3C）。星状細胞（ 図3D）で表さグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）は、星状細胞の分化に重要なマーカーである。高い継代数で、星状細胞は、内皮細胞の分化を誘導する能力を失う。この理由のために、星状細胞培養物は、培養の彼らの時間のために標準化つだけの通路を受けた。 アストロサイトとの共培養が続き、以前の共培養の下部コンパートメントからの条件培地で、ヒドロコルチゾンを補充した培地でRBECを培養する単独で培養RBECと比較してinterendothelialのTJの強い誘導につながった。細胞は、免疫蛍光（ 図4B-D）によって示され、ZO-1およびオクルディンタンパク質についてウェスタンブロット分析によって明らかにされるように、細胞-細胞間結合に局在したオクルディンタンパク質は、 図4E（ZO-1、クローディン5を発現し）。 Cでの形態学的分布ジッパー様の構成でのエル – 細胞接触する単層の（a）の気密性を反映し、（b）は、脳毛細血管内皮細胞の起源、及び（c）は、高度に分化した脳内皮細胞の特徴である。内皮層の傍細胞透過性は、フィルタの上方区画から下方区画へのTEER及びLY（457ダルトン）の流入速度を測定することによりモニターした。 TEERは、EVOMのvoltohmmeterに接続された12mmの培養杯分ENDOHM-12を用いて測定した。のTJの気密性 ​​を示す脳内皮単層のTEERは、（12ウェルプレートのフィルタは、データは示さず）、平均して300オーム·cm 2で達した。 LYのためのPE（PE（LY）、バリアの完全性のコントロールとして使用し、試験化合物と同時インキュベート）は1年間で0.26±0.11×10 -3センチメートル/分（ 図4F）の平均に達した。 RBECの炎症を誘導するために、我々は、広報を用い24時間、5 ng / mlののo-ジ炎症性サイトカインTNF-α、および​​120 ngの/ mlの倍増培養系の上部コンパートメントにRBECによってCCL2（MCP-1）の分泌を測定することにより炎症反応に続く（非250 ng / mlの（ 図5A）にコントロール）で処理した。 PE（LY）の測定（ 図5B）によって明らかにされた24時間5 ng / mlのか、50 ng / mlの時のTNF-α処理もBBBをオープンしました。 P-gpのは免疫細胞化学（ 図6A）によって区別RBECで可視化した。グルタミン酸トランスポーター1（GLT-1）は主に側底画分45中に見出されている間P-gpの局在化は、高度に分極であることが知られており、内皮細胞44の頂端膜において本質的に発現される。我々の培養RBECの偏光の程度を評価するために、頂端及び側底タンパク質は、スクロース密度を用いて原形質膜調製物から分離した46の勾配。ウェスタンブロット解析であった血漿中のP-gpのおよびGLT-1の発現レベルを評価し、頂端および基底膜調製物。新たにラット脳から抽出された微小血管は、これらのタンパク質のインビボ分布（ 図6B）に最も近い正の対照として使用した。微小血管および分化RBEC膜調製物の両方において、P-gpは、主にF1頂端膜画分（ 図6B、C）に局在し、170 kDaのバンドとして表した。 GLT-1の発現は、実際に、65〜70 kDaのバンドとしての微小血管のF3基底膜画分に発現したが、培養したRBECでは検出されなかった。 平行実験では、内皮細胞単層におけるP-gpの機能的活性は、リガンドとしてローダミン123（R123）を用いて試験した。 R123の反管腔側に（AとB）の流出は反対方向（ 図6D）に比べて1.7倍高かった。 P-gpの関与を証明するために、我々はverapami、特定のP-gp阻害を用いL（25μM、30分のプレインキュベーション）とシクロス​​ポリンA（1μM、30分のプレインキュベーション）。ベラパミルおよびシクロスポリン治療で、RBECでのR123の蓄積は、未処理の対照（ 図6E）に比べ、それぞれ1.6倍と2倍に増加した。 受容体媒介トランスサイト（RMT）のメカニズムに関与する受容体 モデルは、LRP1、LDLRかのTfR（ 図7A）のような潜在的に、BBBのトランスサイトーシスの機構に関与異なる受容体の発現のために、さらに特徴づけた。 機能的輸送研究は、LDLRのTfRおよびリガンドを用いて行った。生きRBECは37°C（ 図7B、C）で180分間、CY3（Tfのアビジン-Cy3）で標識したラットトランスフェリンとインキュベートした。 体外 BBBモデルラットにおけるTF-Cy3の取り込みと輸送の定量化は、曲線の傾きがわずかに2400ピコモルを超えて減少した秒（ 図7B）は、結合/取り込みが飽和であることが示唆された。また、結合/取り込みの飽和は下部コンパートメントにおけるTFの蓄積と相関していた。この観察を確認するために、Tfはアビジン-Cy3は4,800ピコモル（プラトー/飽和）（ 図7C）で非蛍光Tfの過剰1,200ピコモル（曲線の上昇する部分）でインキュベートした。これらの実験は、下部コンパートメント内のTF-Cy3の蓄積の減少を示し、私たちのin vitro BBBモデルにおけるリガンド-受容体相互作用の代表的な可飽和メカニズムを確認した。 同様に、LDLRの機能は、内皮細胞単層（ 図7D、E）を横切るそのリガンドDiILDLの取り込みおよび輸送によって実証された。ライブRBECを37℃で30分間DiILDLと共にインキュベートした結合/取り込みは、下の区画（ 図7D）でのDiILDLの蓄積と相関していなかった。ジイルの定量化DLトランスポートは、曲線の傾きは輸送が、我々のモデルでは飽和し、受容体関連であることが示唆された、2μgのを超えて減少した。アジ化ナトリウムは、前DiILDLインキュベーション（ 図7E）に0.05％、15分で添加した。 0.05％アジ化ナトリウムでのインキュベーションの毒性の有無をPeが（LY）測定（データは示さず）によって評価した。これらの実験は、下の区画にDiILDL蓄積を減少させられた。全体的に、我々の結果は、我々 のin vitro BBBモデルでDiILDLためRMTをお勧めします。 ラット脊髄またはマウス脳からの内皮細胞に基づいて他のインビトロ BBBモデル コラゲナーゼ/ディスパーゼが混在する酵素消化は、細胞の生存率および脳微小血管の製造歩留まりの面で制御する主要なパラメータの一つである。酵素の濃度や、より重要な組織への酵素の相対量、Nの比率ラット脳、ラット脊髄およびマウスの脳の間を正確に校正するEEDS。微小血管の播種密度および内皮細胞数が90％コンフルエンス（9日後の微小血管播種）に到達するためには、リンクされ、細胞増殖を改善集団倍加とモデルの質の数を制限する重要なパラメータであるした。ラット脊髄微小血管は、同じ時間スケール内でT75フラスコあたりの細胞の同量を得るために、（組織量、1脳にほぼ対応する2脊髄換算）ラット脳微小血管のために本明細書に記載したものと同様のプロトコールで作製した。彼らは皮質に付いているので5週齢のC57BL6マウスの脳から髄膜を除去することが困難であった。ディスパーゼと脳の簡単な治療は、髄膜の除去を容易にするために表示されます。ラット脳、ラット脊髄およびマウス脳からの再現性の内皮細胞単層の生産に貢献する重要なパラメータが強調表示され、にまとめられている図8。 図1 のin vitro BBBモデル作成の主なステップを要約するチャートフロー。生産プロトコルの異なるステップは、一次内皮細胞培養物の再現性を高めるために、特定の曜日に割り当てた。プロトコルは、5週齢のWistarラットからの微小血管の生産で、最初の週の水曜日に開始されます。 図2 RBEC、星状細胞および共培養系の位相差顕微鏡写真。プレートアウト時に、（A）5週齢のWistar系ラットの微小血管断片。（B）は 4μg/ mlの時のP-gp基質ピューロで2日間処理三日目のRBEC培養。型コラーゲンでコーティングした12ウェルプレートのミリポアフィルターにめっき後、（C）1日目で純コンフルエント内皮単層共培養を表す特徴づけられたハニカム形態を示した共培養の設立の日に挿入フィルタの周囲の細胞単層のIVおよびフィブロネクチン（D）均一性。（E）融合性アストロサイトの文化。（F）スキームC、DおよびEの顕微鏡写真の局在を持つシステム 図3。免疫蛍光顕微鏡によるRBEC培養のキャラクタリゼーション。（A）は、脳内皮細胞は、血小板内皮細胞を表明セル境界部接着分子PECAM/CD31、（B）、フォンヴィレブランド因子（VWF）は、他のものより明るく、一部の細胞においてより凝集比較的点状の染色を示し、核周囲ゾーン中で濃縮した。（C）RBECのピューロマイシン処理なし培養物は、周皮細胞が（緑色）デスミンに陽性免疫染色で検出し、特徴的な小さな丸い核を持っている。（D）アストロサイトはグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）を発現している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 図4。 体外 BBBモデルとの傍細胞透過性のラットの免疫細胞化学特性評価LYは、内皮単層を横断。細胞単層は、内皮の形態およびタイトジャンクションタンパク質の発現と重複しない形態と、典型的な紡錘形細胞とコンフルエント脳内皮細胞単層を明らかにするために、（A）、ビメンチンを用いて免疫染色した（B）クローディン5 、（C）ZO-1および（D）12ウェルBBBモデルにおいても、ZO-1およびオクルディンタンパク質（E）のためのウェスタンブロットによって検出オクルディン、（F）単層の気密性 ​​は、ルシファーイエローの輸送を測定することによって評価したBBBによって保持されることが知られている（LY-CH、ジリチウム塩）、小さな親水性分子（MW 457ダルトン）。簡潔には、LYを、37℃で60分間、脳内皮細胞と接触して培養系の上部区画中でインキュベートしたこの時間の後、下部コンパートメントの培地を回収し、蛍光をspectrofluorimetで蛍光分析により定量した430 nmで励起し、535 nmでの発光を伴うER。結果は、10 -3センチメートル/分で透過性又はPeの中で発現される。 LYのPeは0.6×10 -3センチメートル/分を超える場合に障壁が透過性または開放と考えられている。各1時間の実験中に、平均クリアボリュームは、時間と、線形回帰分析によって推定勾配に対してプロットした。コラーゲンタイプIV、フィブロネクチンのコーティングを有する制御フィルタのクリアランス曲線の傾きは、ポリスルホンおよび脳内皮細胞単層を有するフィルタのためのクリアランス曲線の傾きたPStを付した付した。内皮単層（PSE）用のPS値は、から計算したこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 PSE値は、ポルの面積で割ったOUの膜（12ウェルプレートのミリポアフィルター1.1 cm 2）で、その結果は0.26±0.11×10 -3センチメートル/分の平均値と透過係数（PE）であった。結果は、（アッセイ当たり6単層にN = N = 3の平均値）のn = 90アッセイのための垂直散布図表現されています。 図5。前炎症性薬剤、TNF-αを用いた治療するためのin vitro BBBモデルの応答。培養系からの培養培地は、わずか6時間の上限の区画に5 ng / mlの時のTNF-α処理の前に交換し、12時間および24時間。 RBECによるCCL2の放出は、非処理対照と比較して、ELISAアッセイにより、上部コンパートメントに定量した。 MCP-1レベルは、時間の関数としてわずかに増加することに注意してくださいでも非処理ウェル中。 LY PE（LY）のために内皮Peので測定した内皮細胞バリアの完全性は、5 ng / mlのか、0.62±0.02×10の範囲で50 ng / mlの時のTNF-αで24時間処理することにより、単層の透過性の増加を明らかにした- 0.33±0.03×10 -3センチメートル/分（スチューデントt検定、p <0.05）での対照と比較してそれぞれ3センチメートル /分、0.7±0.01×10 -3センチメートル/分。 P-gp排出トランスポーターとRBEC偏光免疫細胞（A）とウエスタンブロット（B＆C）でアストロサイトとの共培養脳内皮細胞における排出トランスポーターのP-gpの。発現の図6。機能 。細胞膜タンパク質は、細胞タンパク質fractionaで抽出したのTiONキット。原形質膜は、細胞小器官および核を除去するために低張性溶解および微分遠心分離によって得た。原形質膜から頂端及び側底タンパク質の分離は、蔗糖密度勾配によって得た。グルタミン酸トランスポーター1（GLT-1）は、主に側底画分（F3）に局在している間、P-gpのは主に頂端画分（F1）に局在していた。プレーティング前に精製された微小血管は、これらのタンパク質のインビボでの局在化のための対照として使用した。 P-gpの活性は、R123、P-gpのリガンドの輸送極性を測定することにより決定した。 1μMR123のフラックスは管腔から反管腔側（BとA）及び反対側の反管腔側対（AとB）の方向に37°Cで1時間測定した。同様の実験を、インサート·フィルター全体に受動拡散を評価するためにRBECことなく実現され、データはPE（R123）の計算のために、この値を基準に正規化した（ 図5を参照してください。 </st栄> Peの計算方法の凡例）。両区画におけるR123の含有量は、分光蛍光（485 nmの励起波長、535nmの発光波長）を測定した。データは、Peが（R123）に基づいて、管腔側から反管輸送の100％（BのA）として表される。ベラパミル（25μM、30分のプレインキュベーション）とシクロス​​ポリンA（1μM、30分のプレインキュベーション）を参照P-gpの阻害剤として使用された。 RBECでのR123の蓄積は、P-gp阻害（スチューデントのt検定、p <0.05）とのプレインキュベーションの有無にかかわらず、2時間後に測定した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 図7。受容体を介したトラに関与する受容体のキャラクタリゼーションnscytosis（RMT）。（A）分化したRBEC単層を低密度リポタンパク質受容体関連1（LRP1）および低密度リポタンパク質受容体（LDLR）に対する抗体で免疫染色した。 RBECの共焦点画像はDiILDL、LDLRの蛍光リガンドの取り込みのために、そしてラットトランスフェリンのCy3、核周辺領域内のいくつかのクラスタリングを用いて細胞表面上のTFR表示点状の染色、蛍光リガンドの取り込みをプローブした。（B）ラットTF-Cy3のは75、150、300、600、1,200、2,400および4,800ピコモルで差​​別RBEC単層を含む上部区画に追加されました/ 37℃（200μLの上部コンパートメント内および1,200μLの中で180分間挿入下部コンパートメント）。この後、Cy3蛍光は570 Nで550 nmおよび放射で励起し蛍光分光光度計で蛍光分析によって細胞溶解物（PBS200μLの0.1％トリトンX100）にし、下部コンパートメントに定量化したM。蛍光単位は、線形動作範囲を用いてピコモルで形質転換した。（C）飽和実験では、ラットのTf-Cy3では1,200ピコモルで分化RBEC単層を含む上部コンパートメントに添加した/または15せずに37℃で180分間インサート4,800ピコモル/非蛍光Tfのインサートとのプレインキュベーション分。下部コンパートメントにおける輸送は、（B）（スチューデントt検定、p <0.05）のように定量した。（D）DiILDLは1、2、4、8μgの挿入/フィルターで分化したRBEC単層を含む上部コンパートメントに添加した37℃（上部コンパートメント内の200μLと下部コンパートメント1,200μL）で30分間。この時間の後、のDiIの蛍光は571 nmで554 nmおよび放射で励起し蛍光分光光度計で蛍光分析によって細胞溶解液（PBS、0.1％トリトンX100の200μL）にし、下部コンパートメントに定量化した。 Fluorescenceユニットは、線形動作範囲を用いてμgの中に形質転換した。（E）ブロッキング実験輸送のために、アジ化ナトリウムは、2μgの/ 37℃で30分間インサートでDiILDLのインキュベーションの前に、0.05％で15分間添加した下部コンパートメントにおける輸送は、（D）（スチューデントt検定、p <0.05）のように定量した。 0.05％のアジ化ナトリウムのインキュベーションの毒性がないことは、PE（LY）測定（データは示していない）により評価した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 図8 において、ラット脊髄内皮細胞から、またはマウス脳からのインビトロ BBBモデル。ハイテーブルラット脳、ラット脊髄およびマウス脳からの微小血管抽出のための重要なパラメータを点灯します。顕微鏡写真は、ラット脳、ラット脊髄およびマウス脳から調製された内皮細胞単層におけるZO1とオクルディンの免疫染色を示しています。