Vi beskriver en protokol til at undersøge udviklingen af opioid-induceret hyperalgesi og tolerance i mus. Baseret på måling af termiske og mekaniske nociceptive reaktioner naive og morfin-behandlede dyr, det gør det muligt at kvantificere den øgede smertefølsomhed (hyperalgesi) og falde i analgesi (tolerance) forbundet med kronisk opiat administration.
Opioid-induceret hyperalgesi og tolerance alvorligt påvirke den kliniske effekt af opiater som smertestillende i dyr og mennesker. De molekylære mekanismer bag begge fænomener er ikke godt forstået, og deres udredning bør drage fordel af studiet af dyremodeller og fra design af egnede forsøgsprotokoller.
Vi beskriver her en metodisk tilgang til overtalelse, optagelse og kvantificere morfin-induceret hyperalgesi samt dokumenterer smertestillende tolerance, ved hjælp af hale-fordybelse og hale trykprøver i vild-type mus. Som vist i videoen, er protokollen opdelt i fem på hinanden følgende trin. Håndtering og habituation faser tillader en sikker bestemmelse af basal nociceptive respons af dyrene. Kronisk morfin administration inducerer signifikant hyperalgesi som vist med en stigning i både termisk og mekanisk følsomhed, mens sammenligningen af analgesi time-kurser efter akut eller repeated morfin behandling viser tydeligt udviklingen af tolerance manifesteret ved en nedgang i smertestillende responsamplituden. Denne protokol kan ligeledes tilpasses til genetisk modificerede mus for at evaluere rollen af individuelle gener i modulering af nociception og morfin analgesi. Det giver også en model for at undersøge effektiviteten af potentielle terapeutiske midler til forbedring af opiat smertestillende effekt.
Opioid-induceret hyperalgesi (OIH) og smertestillende tolerance begrænse den kliniske effekt af opiater hos dyr og mennesker 1-3. Inddragelsen af pro-inflammatoriske 4,5 eller pro-nociceptive (anti-opioid) 6,7-systemer er i øjeblikket udforskes hypoteser. Belysning af de mekanismer, der ligger til grund OIH og tolerance nødvendiggør en kombination af in vivo og in vitro metoder, ved hjælp af passende dyremodeller, forsøgsprotokoller og molekylære værktøjer.
Behavioral farmakologi er det dominerende paradigme for at overvåge og kvantificere smertestillende og hyperalgesiske stater i forsøgsdyr (rotter, mus). Anvendelsen af en skadelig stimulus (termisk, mekanisk eller kemisk) til en praktisk del legeme (bagpote, hale) af dyret fører til en nocifensive tilbagetrækning, der let kan scores.
Vi foreslår her en metodisk tilgang til overtalelse, optagelse og kvantificere OIH ogtolerance i vildtypemus ved hjælp af hale nedsænkning og hale trykprøvning. Proceduren giver mulighed for en let, følsom og reproducerbar bestemmelse af termiske og mekaniske nociceptive respons værdier i mus. Som vist i videoen protokollen, C57BL / 6 mus oplever betydelige hyperalgesi efter kronisk morfinindgivelse og opretholde denne i flere dage. Både termiske og mekaniske nociceptive værdier er væsentligt reduceret i forhold til baseline målinger på naive dyr. Desuden er vores eksperimentelle opstilling gør det muligt at overvåge, i tillæg til udviklingen af OIH, tilbagegang i smertestillende respons på morfin (tolerance). Præsenteret data understøtter det synspunkt, at hyperalgesi og tolerance kan indebære fælles cellulære og molekylære mekanismer 8,9, selv om dette bestrides i litteraturen 1,10-12. Endelig kan denne protokol tilsvarende tilpasset til genetisk modificerede mus for at evaluere rollen af individuelle gener i modulatortion af smerte. Det giver også en model system til at vurdere effektiviteten af potentielle terapeutiske agenter til at forbedre opiat smertestillende effekter.
Kritiske trin
Valg af dyremodel for nociception målinger
Variation i nociceptive og smertestillende følsomhed blandt mus stammer er blevet undersøgt (anmeldelser 14-16) Anmeldelser ved hjælp af forskellige smerter modeller afviger i deres ætiologi (nociceptive, inflammatorisk, neuropatisk), modalitet (termisk, kemisk, mekanisk), varighed (akut, tonic, kronisk) og stedet for administration (kutan, subkutan, visceral). Når man sammenligner med andre stammer, C57BL/6J ("J" for Jackson Laboratory) mus blev en populær dyremodel for smerte studier, som de udviser en høj basal nociceptive følsomhed 17,18 og en moderat smertestillende respons på opiater 14,19. Efter kronisk morfin behandling, de også udvikle en betydelig smertestillende tolerance 20,21, hyperalgesi 21,22 og afhængighed 20,23.
nt "> Her blev eksperimenter udført på C57BL/6N Tac mus (" N "for National Institute of Health og" Tac "for Taconics gård), som hører til en separat gren af B6 afstamning. Selvom C57BL / 6 mus har været lang betragtes som udskiftelige, seneste undersøgelser pegede på væsentlige adfærdsmæssige forskelle blandt C57BL/6J og C57BL/6N stammerne 24. Især lavere følsomhed af de tre C57BL/6N understammerne (herunder Tac en) akut smerte ved varmepåvirkning kan betragtes som en fordel til afprøvning af denne fænotype.Hanmus blev valgt som størstedelen af smerte gennem anvendelse af mus som dyremodellen udføres på unge mænd 25. I vores hænder, de forudsat robust og reproducerbar data, når de undersøges fra analgesi eller hyperalgesi synspunkt. Indimellem har vi bemærket en tendens til C57BL/6N kvinder til at give flere variable reaktioner, både i TIT og TPT tests. Skønt denne observation kanafspejle naturlige variationer knyttet til hormonelle status hunner overordnede mekanismer bag kønsforskelle i smerte og analgesi stadig en omdiskuteret. Nogle aspekter af denne varme debat vil kort blive præsenteret i den næste 'Begrænsninger af teknikken' sektionen.
Animal tilvænning
Musene blev først lov til at vænne sig til dyret facilitet i løbet af en uge. Svarende til en anden adfærdsundersøgelser, testning blev udført efter en 3 dages-akklimatiseringsperiode (figur 1, trin A). Som nociceptive test er følsomme over for stress, kan første foranstaltninger giver længere ventetid end efterfølgende dem, især i ikke-habituated mus 26,27. Den tilvænning trin giver også mulighed for opnåelse af mere stabile nociceptive respons værdier inden for samme dag og mellem dage figur 2 og 4.. For at reducere døgnrytmen virkninger på nociceptiv og analgetiskfølsomhed 28,29 blev alle tests udført fra 10:00 til 16:00.
Udvælgelse af nociceptive tests
Nociceptive tests bruge enten termisk, mekaniske, kemiske eller elektriske stimuli (gennemgang 26,27,30. Deres valg er kritisk, da forskellige nociceptive modaliteter kan behandles gennem forskellige nociceptorer og fibre 18,31,32.
Vi valgte halen nedsænkning test (TIT) 33, en modificeret version af den klassiske tail flick testen udviklet af D'Amour og Smith 34, og halen trykprøvning (TPT), tilpasset fra Randall og Selitto 35, som eksempler på termisk og mekaniske metoder til at studere morfin-induceret analgesi, hyperalgesi og tolerance i mus. Begge test er ofte blevet brugt i rotter. En afskåret tid systematisk defineret for at undgå eller begrænse risikoen for vævsskader.
Morfin-induced analgesi, hyperalgesi og tolerance
Morfin, den prototypiske mu-opiat-agonist, blev valgt her, da det er en potent smertestillende og OIH-inducer, både hos mennesker og mus 1,2,36. Morfin analgetiske virkning er kendt for at variere med mus stammer, administrationsveje og nociceptive modaliteter. I C57BL / 6 mus, er pålidelig analgesi normalt opnået efter subkutane injektioner af morfin i 1-20 mg / kg dosisinterval 14,21. Derfor valgte vi at studere akut analgesi efter en enkelt administration (sc) af morfin ved 5 mg / kg, tæt på sin ED 50-værdi (7-20 mg / kg) vurderes ud fra termisk nociception 19,21.
Gentagen morfinindgivelse er ofte ledsaget med analgetisk tolerance (hvad enten fra en højredrejning af dosis-respons-kurve eller et fald i smertestillende respons amplitude eller varighed) og hyperalgesi (en forværret følsomhed til smertefulde stimulJeg fremgår af et fald i basal nociceptive værdi). Begge negative fænomener afhænger gnaverrace om arten af opiat-forbindelse, der er valgt, og doseringen på behandlingsvarighed og nociceptive modaliteter 21. For eksempel eksperimentelle paradigmer for at studere tolerance og hyperalgesi består i daglig administration af høj og konstant (20 til 40 mg / kg per dag) 22 eller eskalerende (op til 50 eller endog 200 mg / kg) 20,21 morfin doser. Følgelig vi fremmet udviklingen af hyperalgesi og tolerance i C57BL / 6 mus ved daglig morfinindgivelse (5 mg / kg sc) over en 8 dages periode. Denne moderate morfin dosis blev foretrukket frem højere dem til bedre efterligner klinik brug.
Opsætning af TIT operationelle vindue
En mulig faldgrube i TIT kan være relateret til den rolle, halen i termoregulering gnavere 26,37. Da den omgivende temperatur er en nøglefaktor i nociceptive respons variationer, bør det holdes konstant (her ved 21 ° C) i hele eksperimenter 38. Heat intensitet er normalt sat op til at opdage en nociceptive reaktion inden for 5 til 10 sek 27. Faktisk kan større ventetid øge risikoen for overvågning af flytninger af dyr ikke er relateret til den nociceptive stimulus, hvorimod kortere dem kan reducere forskellen styrken af testen. Vi udførte TIT målinger ved en fast temperatur på 48 ° C. Tilbagetrækning hale latenstider var tæt på 9 sek (basal nociceptive værdi) og varierede fra 4 sek (hyperalgesi) til 25 sek (maksimal analgesi, afskåret). Ud over praktiske årsager kan målinger af nociceptive respons værdier ved en fast temperatur a priori indebærer samme repertoire af nociceptorer og kredsløb og dermed lette fortolkningen af data.
Eventuelle ændringer
Optimering af TIT operationelle vindue til analgesi og OIH overvåNTS
Når der fokuseres på en smertestillende respons, kan lave baseline værdier (højere varme intensitet) fremme påvisningen af en forsinkelse i svaret. Til gengæld for at tage fat på konsekvensen af en smertefuld stimulus eller udvikling af OIH, højere baseline værdier (lavere varme intensitet her 48 ° C), kan det lettere at afsløre hurtigere svar Figur 4..
Selvom vi fandt morfin på 5 mg / kg en bekvem dosis at fremkalde en robust smertestillende respons Figur 3 og fremme (ved gentagen administration) signifikant hyperalgesi figur 4, kan doseringen tilpasses som nævnt før (Kritisk skridt: morfininduceret analgesi, hyperalgesi og tolerance). For eksempel kan lavere doser anvendes til at reducere analgesi amplitude (og dermed undgå cut-off begrænsninger), mens kan vælges højere doser for at fremskynde hyperalgesi debut og øge dens amplitude.
OveRall, optimering af "nociceptive vinduet 'bør tilpasses den genetiske baggrund af mus under undersøgelse og tage hensyn til muligheden for inddragelse af forskellige arrays af nociceptorer og kredsløb.
Alternative opiatagonister (fentanyl, remifentanyl)
Selv om de fleste klinisk anvendte opiater målrette mu-opioid-receptoren som agonister, de afviger betydeligt med hensyn til deres farmakologiske egenskaber, både in vitro og in vivo. For eksempel remifentanyl og fentanyl, i skærende kontrast med morfin, opfører sig som fulde agonister og fremme internalisering af mu-opioidreceptorer 39. Opiater, såsom morfin og fentanyl har halveringstider i størrelsesordenen timer og 40, mens remifentanyl har en ultra-korte halveringstid på flere minutter 41. Hos mennesker, bedste bevis for OIH er fra patienter, der modtog opiater under operationen, herunder korttidsvirkende compounds såsom remifentanyl 2,42. Således kan fentanyl og remifentanyl være værdifulde redskaber for at studere udviklingen af hyperalgesi og tolerance i mus under TIT og TPT paradigmer.
Alternative former for induktion af OIH (kronisk vs akut administration)
OIH ses hos mennesker og dyremodeller som følge af opiat administration, også ved meget lave eller meget høje doser 1,2. Vi rapporterer her om OIH udvikling efter kronisk behandling af mus med moderate doser af morfin. Flere dage til behandling af C57BL/6N mus var nødvendigt klart indebære en og reproducerbar hyperalgesiske tilstand Figur 4 Daglige Morfinindsprøjtninger kunne være tilstrækkeligt erstattet med implanterede morfin piller:. Ved deres fjernelse, har både termisk hyperalgesi og mekanisk allodyni allerede blevet rapporteret i mus 43.. Infusion af opiater gennem en mikro-osmotisk pumpe er en anden mulighed 44.. Hos gnavere langvarig hyperalgesi også opnåelige efter akut administration af fentanyl ved hjælp af en protokol, der efterligner brugen af denne mu-opioid agonist i human kirurgi 36,45,46.
Begrænsninger af Teknik
Dyrearter og modeller for smerte
Komparative studier af talrige musestammer fremlagt beviser for store variationer i nociceptive reaktioner på smertefulde stimuli 17,31,47 og i OIH niveauer efter 4-dages morfin behandling 22.. Uanset om mekanismerne bag smerte behandling og graduering i dyremodeller (mus og rotter), er relevante for kroniske smertepatienter stadig et grundlæggende og åbnede spørgsmål. Således bør megen forsigtighed skal betales til fortolkningen af data fra dyreforsøg og deres forudsigende gyldighed for mennesker 16.
Kønsforskelle i smerte og analgesi
ntent "> De fleste prækliniske studier i dyremodeller for smerte er blevet gennemført på hangnavere 16,25,48. Trods denne selektionsbias, det spirende visningen var at betragte mænd som bedre respons på opiater 49,50, mindre tilbøjelige til at udvikle opioid -induceret hyperalgesi 51,52 og mere tolerante over for morfin analgesi 53 end deres kvindelige modstykker (anmeldelse 54). Men kønsforskelle med hensyn til nociception og smertestillende medicin effekt ikke genoptaget i sådanne "en one size fits all" paradigme. Faktisk et væld af data viser nu, at mange variabler kan påvirke størrelsen og retningen af kønsforskelle såsom opioid effekt og selektivitet, nociceptive assay, genetisk baggrund, alder, gonado-hormonel status eller social interaktion 48,54. Hos mennesker klinisk smerte er mere udbredt hos kvinder, men om denne kendsgerning afspejler faktiske kønsforskelle er stadig et spørgsmål om forhandling 48,55,56. For eksempel, global analyse af halvtreds kliniske studier tyder ingen signifikante forskelle i analgetiske egenskaber mellem kønnene mens meta-analyser udført på patienter-kontrollerede personer pegede på en signifikant større opioid effekt hos kvinder 57. Sidstnævnte observation, som markant kontrast til hvad der har været findes i gnavere, igen rejser flere spørgsmål om oprindelse for sådanne forskelle 16,48,55,57. Sammenlagt findes kønsforskelle i analgesi og fortjener yderligere fokus på de underliggende mekanismer og kliniske implikationer.Om nociceptive tests
Test Tilbagetrækningen hale er en spinal refleks, men det kan være genstand for supraspinale påvirkninger 58. TIT er relativt let at udføre på rotter, men kræver mere ekspertise i mus. En potentiel vanskelighed er at fastholde musen i en korrekt stilling uden at fremkalde uønskede stress. Den foreslåede protokol kan tilpasses efterkohorte størrelse. 16 dyr (8 kontrol og 8 behandlet) er let styres så vidt måling af deres basale nociceptive svarværdier (ved hjælp af TIT først, derefter TPT for hele serien af mus) er under bekymring. Overvågning analgesi tidsforløb kræver etablering af en præcis tidsplan og evaluering af det maksimale antal dyr, der kan testes (TIT først, derefter TPT) inden for bibringes tidsinterval (her 30 min). Hele kohorte af dyr kan således inddeles i undergrupper for at tillade forsøgslederen at respektere kinetiske begrænsninger.
Betydningen af den teknik med hensyn til eksisterende / Alternative Metoder
OIH rotter versus mus
Rotter er blevet flittigt brugt til at studere opioid analgesi, hyperalgesi og tolerance, efter akut eller kronisk opiat administration 46,59-61. Ja, for flere praktiske grunde, at de kan betragtes som overlegen i forhold tilmus som en dyremodel for smerte eksperimenter 16,61. Men indtil for nylig, den generation af genetisk modificerede rotter var ikke en enkel procedure. Som adskillige genmodificerede musestammer er allerede tilgængelige, tilbyder vores model mulighed for at studere bidrag talrige individuelle gener i OIH og tolerance udvikling i mus.
TIT og TPT versus andre nociceptive test
TIT er en variant af halen flick testen, den mest iøjnefaldende forskel er området for stimulation. I modsætning til strålevarme, neddypning af halen i varmt vand fører til en hurtig og ensartet stigning i temperatur. Sammenlignet med andre former for termisk nociception test (hot-plade eller Hargreaves tests), TIT giver nogenlunde reproducerbare resultater både på tværs af og inden for emner.
TPT er en meget populær test for studiet af mekaniske nociception 26,27,35 som sandsynligvis indebærersærskilte nociceptive fibre og molekylære transducere derefter TIT 32. Det giver hurtige og pålidelige målinger 59, men kræver en vis ekspertise fra forsøgslederen og store dyr årgange. Som et alternativ til analgesimeter anvendes i den foreliggende undersøgelse, andre procedurer eller apparat bygger på strain gauges eksisterer (anmeldelse 27). TPT er bedst egnet til at studere mekanisk hyperalgesi henviser von Frey-filamenter normalt træffes for at evaluere mekanisk allodyni (anmeldelse 27).
Fremtidige Programmer eller instruktioner efter Mastering denne teknik
Den eksperimentelle OIH / tolerance model, som vi her præsenterer, kan være tilsvarende indrettet til genetisk modificerede mus for at evaluere rollen af individuelle gener i modulering af smerte. Det giver også et modelsystem til at undersøge effektiviteten af potentielle terapeutiske midler til at lindre kroniske smerter.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS, Illkirch, Frankrig) for hans støtte.
Dette arbejde blev støttet af CNRS, INSERM, Université de Strasbourg BioValley og af tilskud fra Conectus, Agence Nationale de la Recherche (ANR 08 Ebio 014.02) Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol) Communauté Urbaine de Strasbourg (Pharmadol) ICFRC (Pharmadol) OSEO (Pharmadol), Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).
Name | Company | Catalog Number | Comments/description |
C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30g) |
Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS n° 52-26-6 | Delivered with special authorization |
Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml |
Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | G26 ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
Mouse restrainer | Home-made | – | Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples. |
Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
STATview software | Free download; Statistics |