脳スライスビオチン：<em>生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために>の取り組み
Summary
神経細胞の膜輸送を動的に原形質膜タンパク質の可用性と大幅に影響を与える神経伝達を制御します。今日まで、成体ニューロンにおけるニューロンのエンドサイトーシス輸送を測定するために挑戦してきた。ここでは、急性の脳切片における表面タンパク質発現のex vivoでの急速な変化を測定するための非常に効果的な、定量的な方法を記載している。
Abstract
エンドサイトーシス調節トラフィッキングを動的分の時間スケール上の受容体、イオンチャネル及びトランスポーターの細胞表面提示を制御することにより、神経調節様々なイベントを容易に中枢機構である。個々のタンパク質のエンドサイトーシス輸送を制御する機構の幅広い多様性があります。売買の分子基盤を調査する研究は、主に定量的に、外因性刺激および遺伝子操作に応答して、膜タンパク質の表面発現の変化を測定する表面ビオチン化に依存してきた。しかし、このアプローチは、主に忠実に、成人ニューロンにおける遊んで生理学的に関連するメカニズムとは異なる場合があり、培養細胞が挙げられるが、これらに限定されています。また、培養細胞のアプローチは、人身売買の仕組みにおける領域特異的な差異を過小評価することができる。ここでは、急性脳スライス標本に細胞表面ビオチン化を拡張する手法を記載している。我々この方法は、成人ニューロンにおける膜タンパク質の表面レベルの急激な変化を測定するために、忠実度の高いアプローチを提供することを実証する。このアプローチは、神経細胞のエンドサイトーシス輸送の分野において広範な有用性を有する可能性がある。
Introduction
エンドサイトーシスの人身売買は、内在性膜タンパク質の様々な形質膜提示を微調整ユビキタス細胞メカニズムである。エンドサイトーシスは、細胞内環境1に重要な栄養素を提供し、受容体の活性化2に対応して受容体のシグナル伝達を脱感作する。バック形質膜へのエンドサイトーシス再循環はさらに、細胞表面3でのタンパク質の発現レベルを増加させることによって細胞内シグナル伝達を増強することができる。また、膜輸送の摂動は、タンパク質のエンドサイトーシス輸送を支配する分子メカニズムを研究する必要性を強調し、多数の疾患および病的状態に関与している4,5。多くのタンパク質は、古典的なクラスリン依存性内在化機構を利用しながら、過去数年間の証拠をマウントすると、複数のクラスリン非依存エンドサイトーシスの機構が増加、アレイのエンドサイトーシスの可能性を支配することを実証しているタンパク質6,7。従って、生理学的関連システム売買を容易にするエンドサイトーシスの機構を調査する必要性が大幅に高まっている。
脳では、受容体、イオンチャネルや神経伝達物質輸送体のエンドサイトーシスの人身売買は、シナプス可塑8月11日 、最終的には神経細胞の興奮性とシナプス応答に影響を与える虐待12月15日の薬物に対する応答を確立する上で主要な役割を持っています。神経細胞のトラフィッキング研究の大半は、異種発現系または培養一次ニューロンのいずれかに依存して、今日まで、どちらも確実成体ニューロンにおける再生時のメカニズムを反映することができる。ここでは、定量的に成体齧歯類に由来する急性脳スライスにおける表面タンパク質レベルを測定する表面ビオチン化を使用するアプローチを報告する。このアプローチを使用して、我々は、マウスの線条体ドーパミントランスポーターが急速に再内在ことを実証するデータを提示するホルボールエステルにより媒介されるプロテインキナーゼC（PKC）の活性化に応答。
Protocol
Representative Results
Discussion
脳内での批判的な影響シナプスシグナリングエンドサイトーシスの人身売買は、それが定量的に大人の神経細胞内のタンパク質表面発現の変化を測定することが困難な証明されたことを長年の知識にもかかわらず。本研究では、急性脳スライスにex vivoで表面タンパク質を標識するために信頼性の高いアプローチを報告する。彼らはシナプス結合およびその調製時間後に細胞生存率アッ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、裾には、NIHの助成金DA15169およびDA035224によって賄われていた
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
Referenzen
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
