المحفظة المصلي من<em> العقدية الرئوية</em> باستخدام تفاعل الانتباج
Summary
رد فعل الانتباج هو المعيار الذهبي لتقنية التصنيف المصلي العقدية الرئوية. هذه التقنية يستخدم المجهر وأمصال مضادة للمكورات الرئوية محددة، ويستخدم عادة في المختبرات المرجعية والبحثية في جميع أنحاء العالم.
Abstract
هناك أكثر من 90 الأنماط المصلية المحفظة مختلفة من المكورات العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و). فضلا عن كونها أداة لفهم وبائيات المكورات الرئوية، ويمكن المصلي المحفظة توفير معلومات مفيدة لفعالية اللقاح وتأثير الدراسات. رد فعل الانتباج هو الأسلوب المعيار الذهبي لالمكورات الرئوية المحفظة المصلي. ينطوي على طريقة اختبار تعليق خلية المكورات الرئوية مع أمصال مضادة المجمعة ومحددة موجهة ضد السكاريد المحفظة. ويلاحظ ردود الفعل ضد مستضد مجهريا. بروتوكول لديه ثلاث خطوات رئيسية: 1) إعداد تعليق خلية البكتيرية، 2) خلط الخلايا وأمصال مضادة على شريحة زجاجية، و3) قراءة رد الفعل الانتباج باستخدام المجهر. رد فعل الانتباج بسيط معقول لأداء ويمكن تطبيقها في أي مكان هي المجهر مناسبة وأمصال مضادة المتاحة.
Introduction
العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و) هي المسؤولة عن وفاة ما يقدر ب 800،000 طفل دون سن الخامسة سنويا، مع انخفاض عبء المرض في الغالب في البلدان الفقيرة في الموارد 1. الأمراض الرئوية وتتراوح في شدتها من التهابات موضعية مثل التهاب الأذن الوسطى الحاد إلى التهاب حاد تهدد الحياة مثل تعفن الدم، والتهاب السحايا والالتهاب الرئوي 2. وقد وصفت أكثر من 90 الأنماط المصلية المحفظة من المكورات الرئوية 3، 4. لقاحات المكورات الرئوية الحالية توفير الحماية ضد الأنماط المصلية التي هي المسؤولة عن معظم الأمراض الغازية 5، 6. ومع ذلك، فقد ارتبط انتشار استخدام اللقاحات مع استبدال الأنماط المصلية تضمينها في اللقاح عن طريق الأنماط المصلية nonvaccine، سواء في النقل البلعوم وأمراض الغازية 7، 8. هذا يسلط الضوء على أهمية المصلي لالوبائيةالمراقبة وأثر اللقاح على المدى الطويل يدرس 9.
طريقة المعيار الذهبي للكتابة المكورات الرئوية هو اختبار رد فعل المحفظة، والمعروفة باسم تفاعل الانتباج، وصف لأول مرة من قبل نويفلد في عام 1902 (انظر النمساوية 10). تم العثور على درجة عالية من التوافق بين المختبرات، وبين رد فعل الانتباج وأساليب أخرى المصلي 11-13. هناك العديد من الاختلافات في رد فعل الانتباج 10، 14-16. الطريقة الموضحة هنا لا تتطلب استخدام وصمة عار العداد أو عدسة الغمر النفط، بل قطرة من العينة مستعدة مختلطة مع مصل الكتابة ودرست على الفور تحت 400X التكبير.
عادة ما يتم إجراء رد فعل الانتباج باستخدام أمصال مضادة متاحة تجاريا. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم أقل أمصال مضادة مقارنة مع بعض الأساليب الأخرى 16، 17، مما يجعلها أكثر فعالية من حيث التكلفة. مرة واحدة في ISOLيأكلون يتم التعرف على والمكورة الرئوية، يتم اختباره بشكل تسلسلي مع حمامات أمصال مضادة حتى لوحظ من ردود الفعل الإيجابية. كل مصل يحتوي على بركة مخاليط مختلفة من أمصال مضادة التي أثيرت ضد المكورات الرئوية الأنماط المصلية 91 18. مرة واحدة يتم تأسيس تجمع، يتم اختبار نوع الفردية والجماعية أمصال مضادة التي تم تضمينها في بركة على رد الفعل بشكل فردي في التسلسل. نوع أمصال مضادة تتفاعل عموما مع النمط المصلي واحد (على سبيل المثال نوع 1 مصل يتفاعل مع النمط المصلي 1)، في حين أن مجموعة أمصال مضادة تتفاعل مع جميع الأنماط المصلية في مجموعة معينة (مثل المجموعة 22 مصل يتفاعل مع الأنماط المصلية 22F و22A). يتم التمييز بعض الأنماط المصلية داخل مجموعات أخرى باستخدام عامل أمصال مضادة (على سبيل المثال المصلي 22F يتفاعل مع عامل 22B، ولكن ليس 22C). في هذه الحالة هو استمرار اختبار مع جميع العوامل ذات الصلة أمصال مضادة حتى يتم تحديد النمط المصلي 19، 20. رد فعل الانتباج بسيطة وسريعة 14 ويمكن القيام بها في أي ليترaboratory التي هي مجهزة تجهيزا مع المجهر نوعية جيدة ومجموعة مناسبة من أمصال مضادة.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوة حاسمة في هذه التقنية هو ضمان ويستخدم ثقافة نقية لإعداد التعليق جنبا إلى جنب مع إضافة عدد مناسب من الخلايا البكتيرية إلى المرق. تجدر الإشارة إلى أن النمو مستعمرة والتشكل على لوحات أجار يختلف بين عزلات المكورات الرئوية المختلفة. تنتج بعض المستعمرات جافة وخشنة، والذي يمكن أن يكون صعبا لسلخ مع حلقة ولا يستحلب جيدا في المرق. لهذا السبب، فإن اكتساح أكبر من البكتيريا قد تكون مطلوبة عند إعداد تعليق خلية. في أي حال، لا بد من أن الخلايا الفردية، وليس الركام، واضحة في السيطرة السلبية حتى يمكن مقارنة حجمها النسبي للخلايا مع أمصال مضادة المضافة. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي الخلايا البكتيرية كثيرة جدا في ردة فعل سلبية كاذبة، حيث وجود فائض من مستضد محفظي قد تمنع رد فعل الانتباج 10. لهذا السبب، من المهم لإنشاء تعليق البكتيرية مع كثافة الخلية مناسبة (الشكل 1). وسوسيمكن الحفاظ على التقاعد لعدة أشهر عن طريق إضافة عدة قطرات من الفورمالين المركزة. وهذا يتيح أسهل اختبار دفعة وأيضا يعقم مرق الحد من مخاطر العدوى المكتسبة من المختبرات؛ على الرغم من هذا يجب أن يكون وزنه ضد المخاطر السلامة من الفورمالين والمناولة، والتي هي سامة، أكالة، مسرطنة، توعية، والقابلة للاشتعال. بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أن بعض العزلات تظهر ردود الفعل أضعف في وجود الفورمالين (لا تظهر البيانات).
ويتم فحص ردود الفعل الانتباج باستخدام المجهر. استخدام النقيض من المرحلة يعزز من وضوح الكبسولة. في بعض المختبرات، وينظر رد الفعل باستخدام زيت الغمر في 1،000 X التكبير 14، 16. بالإضافة إلى ذلك، استخدام بعض المختبرات وصمة عار مكافحة (الميثيلين الأزرق) لمواصلة تعزيز وضوح رد فعل إيجابي 10 و 16 و 22. ينظر إلى الطريقة المعروضة هنا من دون نفط طmmersion وتحت التكبير 400X 15، 17. هذه الطريقة سريعة وبسيطة وسهلة نسبيا لقراءة 23.
فمن المهم للحفاظ على إجراءات جيدة لمراقبة الجودة الداخلية لضمان إجراءات أمصال مضادة والاختبار في النظام. المشاركة في برنامج لضمان الجودة الخارجية غالبا ما تكون مفيدة.
وجود قيود كبيرة للتفاعل الانتباج لالمصلي من المكورات الرئوية هي التكلفة العالية للأمصال مضادة المطلوبة. ومع ذلك، وهذا هو الحد الأدنى في البروتوكول أعلاه نظرا لكمية صغيرة من مصل المستخدمة لكل رد فعل. وقد وصفت عدة طرق أخرى لالمكورات الرئوية التصنيف المصلي 23، 24. ومع ذلك، لا يزال الانتباج معيار الذهب، وتطوير أساليب جديدة يتطلب توحيد ضد رد الفعل الانتباج 23. باستخدام أمصال مضادة مناسبة، ويمكن أيضا أن تستخدم في تفاعل الانتباج لتحديد واكتب قبعات أخرىالندبة البكتيريا المنتجة 25. رد فعل الانتباج تلعب دورا محوريا في توصيف الأنماط المصلية للمكورات الرئوية الحالية والناشئة، وكذلك توفير المعلومات عن نجاعة اللقاح والتأثير طويل الأجل من التطعيم على النقل والمرض.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس (مشروع PneuCarriage، منحة 52099) وبرنامج دعم البنية التحتية التشغيلية للحكومة فيكتوريا. بفضل ايلين دان، جانيت ستراكان، وكيم هير لقراءة نقدية للمخطوطة.
Materials
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use |
|
| Pneumococcus (Omni) antiserum | SSI Diagnostica | 2438 | Bring all antisera to room temperature before use |
| Optical Microscope | Leica Microsystems | Leica DML | |
| Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl | Copan | CD175S01 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use |
| Heart Infusion (HI) broth | Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne | 40HIN | Bring to room temperature before use |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Lomb Scientific | 7101 | Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container |
| Circular glass coverslips | NeuVitro | GG-5 | |
| *Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers | |||
| *Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not | |||
Referenzen
- O’Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
- Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
- Calix, J. J., et al. Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype. J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).
- Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
- Johnson, H. L., et al. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Med. 8, (2010).
- Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
- Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination. Lancet. 348, 271-272 (1996).
- Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
- Austrian, R. The quellung reaction, a neglected microbiologic technique. Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).
- Konradsen, H. B. Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe. Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).
- Lovgren, M., et al. Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from. J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).
- Reasonover, A., et al. The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).
- Hare, K. M., et al. #34;Dodgy 6As": differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction. J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).
- Kong, F., Gilbert, G. L. Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes. J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).
- Castillo, D., et al. Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , 73-86 (2011).
- Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae. J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).
- Sorensen, U. B. Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera. J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).
- Diagnostica SSI, Key to pneumococcal factor antisera. , (2013).
- Diagnostica SSI, Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use. , (2011).
- Lund, E. Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections. Bull. World Health Organ. 23, 5-13 (1960).
- Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. 32, 165-179 (2013).
- Vernet, G., et al. Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs. Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).
- Casewell, M. W. Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species. J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).
