生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

IMジョーンズによって開発された1629年と：このプロトコルは、マウスkindlin-3遺伝子（FERMT3）が正常に非常に遅くp10プロモーターの下流とベクトルバクミドBAC10 KOとの組換えを可能にするために、バキュロウイルス隣接配列を有していることをベクターにクローニングされていることを前提としています同僚28。このプロトコルでは、kindlin-3遺伝子はpOPINE 29にクローニングし、使用したプライマーおよびクローニング戦略は、他の場所で12に説明されています。 FERMT3遺伝子 （kindlin-3）のp10バキュロウイルスプロモーターの制御下にあり、ベクターは、5 'UTR/ORF603およびORF 1629を含み、下流の精製の ​​ために29 C-末端His 6 -タグをコードするようにプラスミドを設計される。 1。昆虫細胞培養とメンテナンス組換えバキュロウイルスの増幅の前に、懸濁培養に適応し、ヨトウガ細胞 （Sf9細胞）べきである成長させ、維持する。 昆虫細胞は、常に専用の組織培養ヒュームフード内の無菌技術を使用して処理する必要があります。 昆虫細胞の懸濁培養物を100μg/ mlのペニシリンおよび100 rpmで振とうしながら27℃のフラスコで100μg/ mlのストレプトマイシンを補充したのSf-900 II（SFM）無血清液体培地中でインキュベートする。 昆虫細胞培養密度範囲を維持6×10 1との間-分離及び新鮮なのSf-900 II培地で細胞培養物を希釈することにより細胞/ mlの1×10 7。 注：健康 細胞は大きさが均一になるはずですし、形状が球形である必要があります。 培養の細胞密度を計算するために、血球計数器および光学顕微鏡を用いて試料体積中の細胞を数える。 2。組換えバキュロウイルスの生成 100μg/ mlのpenicilliを補ったのSf-900 II培地を使用して懸濁液中でSf9細胞を培養し、維持Nおよび100μg/ mlのストレプトマイシン。 1×10 6細胞/ ml -バキュロウイルス生成のために、昆虫細胞を5×10 5の密度範囲に培養されるべきである。 種子のSf-900 2mlの100μg/ mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを補充した培地中の滅菌II、6ウェル組織培養プレートのウェルあたり約1×10 6個のSf9細胞。プラスチックウェルの底に付着し、ドラフト内で室温でSf9細胞を残すため、単層を形成する。 単層培養にバクミドDNAとプラスミドDNAをコトランスフェクトすることにより組換えバキュロウイルスの生成を行う。 抗生物質を含まないのSf-900 II SFM（A液）100μl中1629：各トランスフェクションのために、精製されたBAC10 KOの0.5μgの、ORF1629バキュロウイルス要素を持っている、精製pOPINE-mFERMT3、1〜2μgのを混ぜる。 別のチューブでは、抗なしでのSf-900 II SFM100μlのセルフェクチンII試薬の6μLを希釈各トランスフェクション反応（溶液B）のための抗生。多くのトランスフェクションが必要な場合は「マスターミックス」は、減少した液体処理のために、ここで作成することができる。 二つの溶液（A及びB、約200μl）を混合し、脂質-DNA複合体を形成するために室温で20分間インキュベートする。 抗生物質を含まない800μLのSf-900 II SFMと脂質-DNA複合体を希釈します。慎重にさせたSf9細胞単層メディアを吸引し、慎重にしたSf9単層の上に溶液A / Bおよびメディアをピペット。 27°のCO / Nの加湿インキュベーター中でトランスフェクションされた細胞を培養すると、次の日に、各単層培養に抗生物質を含まないのSf-900 II SFMをさらに1ミリリットルを追加します。さらに5日間、27℃で細胞を培養する。 培養液（合計約2ミリリットル）から直接、組換えバキュロウイルスを収穫し、きれいな遠心管（例えば15ミリリットルファルコンチューブ）に移す。 任意のSf9細胞のDEBRを明確にRTで5分間、1,000×gでの遠心分離によってである。使用するまで暗所に4℃できれいなチューブおよび格納するために、得られた上清中にあるとP1で示さウイルスを、転送します。この段階で、残りのSf9単層は、昆虫細胞における組換えkindlin-3の存在を評価することにより、組換えウイルスの生成を評価するために使用することができる。 0.5ミリリットルのPBSで単層を再懸濁し、2X SDS-PAGEローディング緩衝液の等容量の10μlのサンプルを希釈。少なくとも10分間、> 95℃でサンプルを加熱する。 それは適切なゲルローディング用の粘性が高すぎる場合には、マイクロ超音波処理装置のチップを使用して、10％の振幅で1秒間のサンプルを超音波処理。 3。組換えバキュロウイルスの増幅懸濁液中のウイルスの増幅のために、1.4×10 6細胞/ mlの細胞密度を使用し、これは（ すなわち 、50ミリリットルの培養フラスコ中の総容積の1/20を占めるべき2 Lのフラスコ）。 以下の式を用いて0.1の感染多重度（MOI）でのP1ウイルスストックで昆虫細胞培養物を感染させることにより、組換えウイルスの増幅を達成する; 注：P1ウイルスの生成は、1×10 7 pfu / mlでの予想されるウイルス力価を有すると仮定することができる。しかし、プラークアッセイの前に、この段階を行うことができる。 3日間（72時間）100rpmで振盪しながら27℃で、P1感染昆虫文化をインキュベートする。 RTで5分間1,000×gでの遠心分離によって培地から細胞を分離することによって、ウイルスを収穫する。 SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによってkindlin-3タンパク質の発現を評価することによって組換えウイルス産生の確認のために、この段階で得られた細胞ペレットを保存します。 4℃の中できれいなチューブおよび格納するために明らかにしたウイルスに富んだメディアを転送使用するまで暗い。このウイルスストックは、P2と表記されている。 注：2×10 8 pfu / mlで（又は100 PFU /細胞の増幅率）のウイルス力価が期待できる。 4。バキュロウイルス感染Sf9中kindlin-3の発現精製前のための大規模な組換えkindlin-3の発現に100μg/ mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを補充のSf-900 II SFM中で懸濁液中のSf9細胞培養の適切なボリュームを拡張。 100 rpmで振盪しながら、総培養体積で27℃で懸濁培養をインキュベート1:5の体積比フラスコ。 2×10 6細胞/ mlの密度で、Sf9細胞の懸濁培養物を感染させる。 補足最終濃度1％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）を用いてSf9培養物を1のMOIを与えるために、増幅された組換えウイルス（P2ウイルスストック）とした。 100 rpmで振盪しながら27℃で感染培養をインキュベートする。 収穫recombinaNT kindlin-3-CHIS 1,000×gでの遠心分離によりSf9細胞を72時間後に感染の6発現 得られた細胞ペレットを使用するまで-20℃で保存し、または長期保存のために-80°C。 5。組換えKindlin-3の精製氷上での組換えkindlin-3を発現して解凍凍結し、バキュロウイルス感染昆虫細胞（Sf9細胞）のペレット。 EDTA不含プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびDNase1の1,000〜2,000 Uを補充し、溶解緩衝液（50mMのトリス-HCl、pH7.5、500mMのNaCl、1％（v / v）のTween-20を含む）で解凍し、細胞ペレットを再懸濁する。 注：NaCl濃度は、内因性のSf9細胞のタンパク質および下流の精製に使用し、固定化金属アフィニティーカラム（下記参照）との間の非特異的な相互作用を防止するために、500 mMまで調整される代わりに、修飾されたリン酸緩衝生理食塩水（PBS）も使用することができる。 洗剤とVOで再懸濁した細胞をインキュベートすることにより細胞を溶解rtexing。超音波処理、代替的（40％振幅、10秒の冷却に続いて10秒パルスの10サイクル）氷浴中でさらに細胞破壊のためのサンプルまたはダウンスホモジナイザーを使用しています。 4℃で1時間、48,000 xgでの遠心分離によって溶解物を明らかにする1ml /分の速度で4℃で、溶解緩衝液で予め平衡化したHisTrapカラム（5ミリリットルカラム体積）上に得られた上清をロードする。 注：別の方法として、明らかにした溶解物を1〜2時間、4℃で予め平衡化したニッケルセファロースビーズ1-5 5mLベッドボリューム（ 例えばニッケルセファロース6ファストフロー）と共にインキュベートすることができる。ニッケルセファロースカラムに重力流カラムを用いることによって結合工程の後に形成することができる。 未結合のタンパク質を除去するために洗浄緩衝液（50mMのトリス-HCl、pH7.5、500mMのNaCl、10 mMイミダゾール）の10カラム容量でカラムを洗浄する。 溶出するためにアクタFPLCを使用して10月/ mlの（または10カラム容量内）の割合で10〜10mmで、リニアイミダゾール勾配を使用して、結合された組換えkindlin-3-CHIS 6。 通常、300mmのイミダゾール濃度で溶出kindlin-3-CHIS 6を含む画分と、アクタFPLCを使用して0.5〜1ミリリットルの画分に溶出を分画。 SDS-PAGEで溶出液のタンパク質組成を評価し、初回の精製に抗His 6抗体または抗マウスkindlin-3抗体を用いたウエスタンブロット法により確認してください。 20mMのトリス-HCl、pH7.5、200mMのNaCl 50kDaの分子量カットオフ（MWCO）を用いてタンパク質を遠心濃縮器を用いて、緩衝液および試料濃度への希釈系列を介して内kindlin-3およびバッファー交換を含む画分をプール4℃で注意：代替的に、20mMのトリス-HCl、pH7.5、200mMのNaCl中にO / Nを4時間、4℃で30 kDaのMWCOを用いてスライド-A-ライザー透析カセットを用いてタンパク質溶液を透析する。 注意：イオン交換のために（下記参照）のNaClの濃度が低い、 <eすなわち、50mMのmは>することができ、この工程のために使用されてきた。 0.5ml /分の速度でアクタFPLCを用いて予め平衡化したHiTrapヘパリンHPカラム（5ミリリットルカラム体積）上に緩衝液交換したタンパク質溶液を適用する。 注：結合したkindlin-3は、線形NaCl勾配を用いて溶出される（1 MのNaCl、0.2 M NaCl）を同じ緩衝液中で、10mMの/ mLの割合で増加させる。 Kindlin-3-CHIS6は〜0.6MのNaClで溶出することが期待されている。 0.5〜1ミリリットルの分画に溶出を分別し、適切な場合には、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法によるタンパク質組成物を評価する。 注：SDS-PAGEによって評価される一方、近い95％のタンパク質純度を期待できる。 プール画分をkindlin-3を含む0.5〜2 mlの最終容積に50 kDaのMWCOを有する遠心タンパク質濃縮器を使用して集中。 最終工程において、濃縮タンパク質を研磨し、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いてタンパク質を緩衝液交換。 蘇上に精製タンパク質を適用perdex S200（16/60）又は（10/30）カラムのサイズに応じて、1ml /分または0.5 ml /分の速度で20mMのトリス-HCl、pH7.5、200mMのNaCl、1mMのDTTで予め平衡化使用。 注：必要に応じて、サイズ排除クロマトグラフィーはまた、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で行うことができる。 使用されるカラムのサイズに応じて1ml /分または0.5 ml /分の速度でカラムにバッファーを適用することによって、サイズに応じてタンパク質を精製する。 注：カラムから溶出したタンパク質を分画しであり、280nmでの吸光度を用いてモニターした。 単一の吸光ピークは、均質性を決定するために分画し、SDS-PAGEによって評価され、この工程の後に、典型的には> 95％の純度であるSECから期待されるべきである。 〜15 mg / mlの、評価されるように、分光光度法109320 Mの計算された吸光係数（ε）を使用するために-1センチ-1 <50 kDaのMWCOを有する遠心タンパク質濃縮器を用いて、精製kindlin-3-CHIS 6を集中/商標>（すべてのシステイン残基が低減されると仮定して）。 -80℃〜-20℃で長期保存における貯蔵のために、アリコートをPCRチューブ及びフラッシュ凍結し、液体窒素中でサンプルへのタンパク質。あるいは、タンパク質は、生化学的および生物物理学的多くの技術を用いて調査のために直接使用することができる。