ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究
Abstract
貪食細胞はそのファゴソーム内侵入する微生物を除去して除去することにより、自然免疫系において主要な役割を果たしている。ファゴソームの成熟は、新生ファゴソームが細胞質内の種々の細胞小器官とコンパートメントよく編成の相互作用を介して抜本的な転換を受けている間、複雑で厳密に調節されたプロセスである。その溶解性と殺菌性とファゴソームを持たせることにより、食細胞の生理機能に必須であるこのプロセスは、リソソームとファゴソームのための成熟の最後と重要な段階であると考えられているファゴリソソームの生合成とファゴソームの融合で絶頂に達する。本稿では、ファゴリソソーム生合成の特徴であるコンテンツ配信を、ファゴソームするリソソームの動的な過程の定性的および定量的分析のための生細胞イメージングベースの方法を説明します。このアプローチは、phagocyのモデルとしてのIgGでコーティングされたマイクロビーズを使用しています管腔リソソーム貨物プローブとしてtosisと蛍光団結合デキストラン分子、タイムラプスイメージング、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用してライブマクロファージにおけるリアルタイムにファゴソームにlysosmalコンテンツの動的配信を追跡するために。ここでは、準備手順や他のラボで、この方法の簡単で正確な展開を可能にするためのステップバイステップの実験、詳細に背景を説明します。我々の記載された方法は、単純な堅牢な、そして最も重要なことは、容易に異なるシステムや様々な食細胞タイプ、機能喪失実験を、異なるプローブの使用などの様々な実験設定でファゴソームの相互作用および成熟を研究するために適合させることができるであり、そして貪食粒子。
Introduction
マクロファージを含む専門的な食細胞は、免疫系で重要なを果たしている。先天性免疫系における最初の防衛線であることに加えて、それらはまた、それらのシグナル伝達およびロール1-3抗原提示を介して適応免疫の活性化において重要な役割を果たす。専門的な食細胞の機能は多面的ですが、ファゴソームの成熟は、プロの食細胞4,5の殺菌及び抗原処理機能の重要なバックボーンです。受容体を介した貪食や細菌などの貪食ターゲットの取り込み時には、発生期のファゴソームは、相互作用し、エンドサイトーシスネットワークのコンパートメントおよび他のいくつかの細胞小器官6の交流の複雑でよく編成シーケンスを通過します。化合物の性質は、これらの細胞の実体だけでなく、規制と交換し、融合事象のタイミングは、管腔ファゴソーム環境とphagosを決定OMALの膜組成と、このように7、成熟ファゴソーム8の運命。
ファゴソーム成熟の生理的関連性は、から逃げる停止またはファゴソーム成熟9を破壊するために、様々な細胞内病原体によって使用される多様な戦略によって例示される。これらの戦略の最も直接的または間接的にファゴソームの成熟過程の最終的かつ重要な段階を防ぐ：加水分解酵素と成熟ファゴソーム7の抗菌要因の大部分とそれらを賦与後期エンドソーム/リソソームコンパートメントファゴソームの融合、 、8,10。この最終的な重要なステップの分析は、したがって、ファゴソームの成熟の状態について、自然な生理的な状態は、正または負に利用されている特定の実験設定で影響を受けているかの強力な指標を提供してくれることができます。
後期エンドソーム/リソソーム区画sが、一般に種々のステージ特異的マーカー分子の存在により早期エンドサイトーシス区画から、エンドサイトーシス経路の末端区画とみなす定義され、区別される。例えばこのような他の人の間で11リソソーム関連膜タンパク質（ランプ）などの加水分解酵素や膜成分のため。ターミナルエンドサイトーシスは、区画-今後リソソームは、また、食細胞/エンドサイトーシス経路12の最後に消化の最終段階のための主要な場所として機能し、単にと呼ばれる。このように、難消化性プローブは、細胞外環境からのエンドサイトーシスおよびマクロピノによってロードすることができ、それを取り込み、チェイスの定義されたサイクルに従った後13,14を蓄積リソソームへのエンドサイトーシス経路を通って輸送される。 15-17 endocyticprobesなどの有機難消化性高分子デキストランのような蛍光顕微鏡用の蛍光団結合プローブは、一般的に使用されている。
<p clasこの方法ではs = "jove_content">、我々は、ファゴソーム、リソソーム内腔にコンテンツの配信を分析することによって、ファゴソーム成熟を研究する貪食カーゴとしてIgGをコーティングしたマイクロビーズの使用を記載している。ライブ骨髄由来マクロファージ（BMM）、共焦点レーザー走査顕微鏡でタイムラプスビデオ画像内のリソソームの容易に検出可能なマーカーとして蛍光団結合デキストランプローブを用いて、我々は高とファゴソームへの貨物輸送の動的なプロセスに従う時間分解能。次に、フィジー（又はImageJの）収集タイムラプス撮影データは、オープンソース、無料利用可能な画像解析ソフトウェアを用いて評価することができる方法を説明し、統計的にMicrosoft Excelを用いて解析し、グラフパッドプリズムソフトウェア14,18を用いて提示した。我々の方法の説明に続いて、類似の実験は、ファゴソーム成熟に対するそれらの影響を調査するために変更された設定および因子を使用して設計することができ、実質的に任意のオト付着性の一次または細胞ラインの貪食細胞の彼女のタイプ、遺伝子ノックアウトやノックダウンを、変異体または融合タンパク質の発現、食細胞 – ターゲット、マイクロビーズコーティング化合物、エンドソーム/リソソームプローブや要因などAを含む機能実験の遺伝的損失とりわけ、サイトカイン、化学阻害剤、またはsiRNAは、この方法の基本的なアプローチを適用することができるすべての変数である。
私たちは、このメソッドは次のようにするという目標や基本的な要件を定義します。
- この方法の目標：食細胞を生きた高い時間分解能でファゴソームの成熟の、直接的な定量的および定性的観察と分析を可能にする。
- 貪食貨物：適切にコーティングされた微粒子または生物学的標的。ここでは、容易に食作用を媒介するのFc-γ受容体を介して内在化さIgGをコーティングした3μmの球状のポリスチレン微粒子を使用しています。代わりに、任意の微生物またはコーティングされたMIC貪食受容体が細胞上に存在するためにroparticleを使用することができる。
- 食細胞：適切な貪食受容体を発現する接着食細胞。ここでは、豊富のFc-γ受容体を発現するマウス初代BMMSを使用しています。あるいは、樹状細胞（DC）、単球または食作用上皮細胞またはそれらの遺伝的変異体またはノックアウト変異体を使用することができる。
- リソソーム貨物：蛍光標識したリソソームプローブ。ここで、テキサスレッドコンジュゲート7万キロダルトンのデキストラン（Dex70kD）はリソソームの管カーゴとして使用される。あるいは、そのような酸味や、分解能力などのファゴソームプロパティの細胞区画または細胞小器官、または適切なプローブのいずれかの蛍光検出可能なマーカーは、ファゴソーム成熟の進行を研究するために使用することができた。
- 例えば分子、化学化合物、遺伝子ノックダウン、または変異タンパク質の一過性発現を可能性があり、シグナリング：要因に影響を与える。ここでは、FORGを持っている簡単のためにこのような因子の1使用していますが、変異型タンパク質の発現およびKasmapour ら 18ファゴソームの貪食や状況と移動性に影響を与えると/できるあらゆる要因を参照してくださいノックダウンに影響を与える要因との最近の例または成熟ファゴソームと対話コンパートメントは、潜在的に使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
次のセクションでは、提示された方法とその限界の重要なステップを説明します。さらに、我々は、その解決策の一般的な問題のいくつかを接続可能な修飾を導入し、本手法の利点だけでなく、このアプローチに適し補完的な方法を検討していきます。
ビーズ表面へのIgGの結合を含むビーズの調製は、重要であり、unfresh製剤の使用は避けるべきである。それへの追加で?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿の重要な読書のためのファゴソームの生物学研究室のメンバーに感謝。この作品は、ヘルムホルツ若手研究助成（イニシアティブやヘルムホルツ協会のネットワーク化ファンド） と優先プログラムドイツ研究協会（ドイツ学術振興、DFG）のSPP1580グラントによってサポートされています。
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
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