Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza

La produzione di proteine antigelo (AFP) è un importante meccanismo di sopravvivenza di alcuni organismi che vivono in ambienti carichi di ghiaccio. Fino a poco tempo fa, si pensava che l’unica funzione degli AFP fosse quella di prevenire o rallentare la crescita di cristalli di ghiaccio interni che avrebbero bloccato la circolazione, causato danni ai tessuti e stress osmotico. Gli organismi che non possono tollerare alcun grado di congelamento, come i pesci, esprimono ARP per inibire completamente la crescita dei cristalli di^{ghiaccio 1}. Altri, come l’erba, sono tolleranti al congelamento ed afps espliciti per inibire la ricristallizzazione del ghiaccio che riduce la formazione di grandi cristalli di ghiaccio nei loro^{tessuti 2}. La stabilizzazione delle membrane a bassa temperatura è un’altra funzione suggerita per gli AFP³. Recentemente, è stato suggerito un nuovo ruolo per l’AFP di un batterio antartico, Marinomonas primoryensis, dai laghi salmastri ricoperti di ghiaccio⁴. Questo AFP fa parte di una proteina adessina molto più^{grande 5} che si pensa alleghi il batterio al ghiaccio per un migliore accesso all’ossigeno e ai nutrienti⁶. Altri microbi sono noti per secernore gli ARP, che potrebbero alterare la struttura del ghiaccio in cui vivono⁷.

Gli ARP sono stati trovati in alcuni pesci, insetti, piante, alghe, batteri, diatomee e funghi. Hanno sequenze e strutture notevolmente divergenti coerenti con la loro evoluzione da diversi progenitori in varie occasioni; eppure tutti si legano al ghiaccio e inibiscono la sua crescita con il meccanismo di adsorbimento-inibizione⁸. Gli ARP hanno ciascuno una superficie specifica che funge da sito di legame con il ghiaccio (IBS). Questi sono stati tipicamente identificati dalla mutagenesi site-directed dei residui superficiali^9-11. Si ipotizza che l’IBS organizzi molecole d’acqua in uno schema simile al ghiaccio che corrisponde a specifici piani di ghiaccio. Così l’AFP forma il suo ligando prima di legarsi^{ad esso 5, 12}. I piani di ghiaccio possono essere definiti dai loro indici di Miller, e diversi ARP possono legarsi a piani diversi. Pertanto, il tipo I AFP dalla passera d’inverno si lega ai piani piramidali 20-21¹³, tipo III AFP lega sia il prisma primario che i piani piramidali utilizzando una superficie di legame del ghiaccio^{composto 11,14}, mentre il budworm abete rosso AFP, un AFP iperattivo, si lega contemporaneamente sia ai piani primario che basale^15,16. Altri ARP iperattivi, come mpAFP, si legano a più piani di ghiaccio come dimostra la loro copertura completa di singoli emisferi di cristallo di ghiaccio^5,17. Si ipotizza che la capacità degli AFP iperattivi di legare il piano basale, così come altri piani, possa tenere conto della loro attività 10 volte superiore rispetto agli AFP moderatamente attivi¹⁸. Sebbene l’efficienza degli AFP iperattivi sia ben documentata, la loro capacità di legarsi a più piani di ghiaccio non è ancora compresa.

Il metodo originale per determinare gli aerei di ghiaccio legati all’AFP è stato sviluppato da Charles Knight^13,19. In questo metodo, un cristallo di ghiaccio singolo macroscopico è montato su un’asta metallica cava (dito freddo) e formato in un emisfero immergendolo in una tazza emisferica piena di acqua degassata. Quindi, l’emisfero viene immerso in una soluzione diluita di ARP e uno strato di ghiaccio viene coltivato dalla soluzione AFP sull’emisfero cristallino di ghiaccio per diverse ore controllato dalla temperatura del glicole etilenico che circola attraverso il dito freddo. Il cristallo di ghiaccio viene rimosso dalla soluzione, staccato dal dito freddo e posto in una stanza congelatore da -10 a -15 °C. La superficie viene raschiata con una lama affilata per rimuovere il film superficiale congelato della soluzione proteica antigelo e il cristallo di ghiaccio può sublimare per almeno 3 ore. Dopo la sublimazione, i piani di ghiaccio legati dagli ARP possono essere visti come modelli incisi bianchi derivati da proteine residue. L’emisfero di ghiaccio può essere orientato al suo asse ce a-assi, per localizzare i piani basali e prismaci del ghiaccio, e determinare gli indici di Miller delle macchie incise.

Qui descriviamo una modifica del metodo originale per determinare i piani di ghiaccio legati all’AFP, un metodo che definiamo affinità del piano di ghiaccio a base di fluorescenza (FIPA)¹¹. Gli ARP sono etichettati fluorescentmente con un tag chimerico, come la proteina fluorescente verde (GFP)^11,16,17,20, o con un colorante fluorescente legato covalentemente all’AFP^5,21. Gli AFP etichettati fluorescentmente sono adsorbiti in un singolo cristallo di ghiaccio e ricoperti dalla stessa procedura sperimentale degli esperimenti originali di incisione del ghiaccio. L’estensione del legame AFP con l’emisfero di ghiaccio in crescita può essere monitorata durante l’esperimento utilizzando una lampada ultravioletta (UV). Al termine dell’esperimento, l’emisfero può essere tolto direttamente dal dito freddo e immaginato, senza sublimazione. Tuttavia, se lo si desidera, l’emisfero può essere lasciato sublimare per visualizzare un’incisione di ghiaccio tradizionale. Le modifiche introdotte alla metodologia FIPA accorciano di diverse ore il tradizionale protocollo di incisione del ghiaccio. Inoltre, c’è il potenziale per l’imaging simultaneo di diversi AFP, ognuno con un’etichetta fluorescente diversa, per visualizzare i modelli sovrapposti dei piani di ghiaccio legati all’AFP.