מיון של<em> Streptomyces</em> פלטות ניידים באמצעות אובייקט מורכב פרמטריים מנתח וסדרן
Summary
תרבויות Streptomyces-גדל נוזל מאופיינים בכדורי mycelial כי הם הטרוגנית בגודל. אנחנו כאן מתארים שיטה לניתוח וסוג כזה כדורים באופן תפוקה גבוהה. כדורים אלה יכולים לשמש לניתוחים נוספים, אשר יספק מוביל להבין ולשלוט ההטרוגניות צמיחה.
Abstract
Streptomycetes הם חיידקי אדמת פילמנטיות המשמשים בתעשייה לייצור אנזימים ואנטיביוטיקה. כאשר גדלו בbioreactors, אורגניזמים אלה יוצרים רשתות של העובש ביניהם, המכונה כדורים, שהם הטרוגניים בגודל. כאן אנו מתארים שיטה לניתוח ולכדורים מסוג mycelial באמצעות אובייקט מורכב פרמטריים מנתח וסדרן (Copas). מקבלות הוראות מפורטות לשימוש במכשיר ואת הניתוח הסטטיסטי הבסיסי של הנתונים. יתר על כן אנו מתארים כיצד ניתן למיין כדורים בהתאם להגדרות משתמש מוגדר, המאפשר עיבוד במורד הזרם, כגון הניתוח של RNA או תכולת חלבון. שימוש במתודולוגיה זו ניתן לטפל הצמיחה הטרוגנית הבסיסית המנגנון. זה יהיה סייע לשיפור streptomycetes כמפעל תא, בהתחשב בעובדה שהפריון בקורלציה עם גודל גלולה.
Introduction
Streptomycetes הם חיידקי פילמנטיות אדמה שידועים היטב למיומנות שלהם כדי להפוך את האנטיביוטיקה, כמו גם תרכובות שיכולים לשמש כשמה כן היא, או כדי להילחם בזיהומים פטרייתיים או 1,2 הסרטן. בנוסף, אורגניזמים אלה מייצרים אנזימים שיש בם עניין למגוון רחב של יישומים תעשייתיים 3. רוב התרכובות מעניינות מסחרי אלה מיוצרים בbioreactors. צמיחה של streptomycetes בbioreactors מאופיינת על ידי היווצרות של מבנים מורכבים של העובש ביניהם, הידועים כגושים או כדורים. מבנים רב תאיים אלה הם הטרוגנית מאוד ביחס לגודל 4 ויכולים להגיע לגדלים שהם יותר ממיליון פעמים גדולות יותר מאשר חיידק חד תאי כגון Escherichia coli או Bacillus subtilis. למרות ההטרוגניות נחשבת כתכונה מועילה במערכות ביולוגיות טבעיות 5, זה נחשב מכשול ייצור בתעשייה. ביוcultivations כור צריך להיות לשעתקו ושליטה כדי להשיג התשואות הגבוהות ביותר אפשריות. הבנה מפורטת של תפקידו של כל אחד מהסוגים גלולה בbioreactor לכן חיונית כדי לשפר streptomycetes כמפעל תא.
Cytometry זרימה משמשת בדרך כלל כדי לנתח תאים בודדים באוכלוסייה 6. cytometers הזרימה יכול לרכוש מידע multiparametric זמנית על ידי מדידת מאפיינים של התאים (כגון גודל, צפיפות, וקרינה ססגוני). בדרך זו, יכולים להיות מתואם מאפייני תא ובכך תורמים להבנה שלנו של ההטרוגניות בתוך תרבות ואת קיומם של אוכלוסיות שונות של תאים 6. מכשירים יותר מיוחדים הפכו אותו ניתן למיין תאים על פי פרמטרים המוגדר על ידי משתמש. לדוגמא, יכולות להיות מוקרנת מוטציות. בעקבות מיון, יכולים להיות מתורבתים תאים שעברו מוטציה כזו לאפיון נוסף. זה כבר הוכיח את עצמו שימושי, בין השאר,כדי לשפר את הפרודוקטיביות של זני 7,8. חרירי זרימת cytometers בדרך כלל לאפשר המעבר של תאים בקוטר מרבי של כ 10 מיקרומטר. לכן, גלולות של streptomycetes לא יכולות להיות מנותחות עם הזרימה cytometers הרגיל. הם, לעומת זאת, יכולים להיות מנותחים עם האובייקט מורכב פרמטריים מנתח וסדרן (Copas). כמו הזרימה cytometers הרגיל, Copas יכול לרכוש נתונים multiparametric של חלקיקים באופן תפוקה גבוה. בהתאם לסוג של Copas ניתן לנתח 10-1,500 מיקרומטר בגודל חלקיקים. בנוסף, היא מאפשרת למיון של חלקיקים בודדים שיכול לשמש לטיפוח או ניתוחים במורד הזרם, כגון הבידוד של DNA, RNA, או חלבונים. Copas תוכנן בתחילה לניתוח ומיון של אורגניזמים רב תאיים קטנים, כגון elegans נמטודות Caenorhabditis 9, ועוברי דרוזופילה וזחלי 10. המכשירים יש גם שימשו ל11 דג הזברהnd ל12,13 פטריות פילמנטיות. גם אורגניזמים האחרונים יוצרים כדורי mycelial שהם אפילו גדולים יותר מאלה שנוצרו על ידי חיידקי פילמנטיות. אנחנו הוכיחו לאחרונה כי השימוש בCopas הוא גם ריאלי עבור streptomycetes 4. אנחנו כאן מתארים את ההליך הניסיוני לשימוש בCopas כדי להעריך את ההטרוגניות גלולה בcoelicolor Streptomyces, כולל פרטים על המתודולוגיה למיין כדורים לפי גודל. שים לב, עם זאת, כי בשיטה זו יכולה לשמש גם לניתוח streptomycetes יוצרי גלולה האחר.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytometry זרימה אפשרה הניתוח המהיר של כמויות גדולות של תאים בודדים, אשר תרם להבנה של ההטרוגניות שלנו באוכלוסיות משובטים 6. cytometry זרימה הסדיר הוא לא ריאלי עבור ניתוח של כדורי mycelial תאיים של streptomycetes ופטריות. העבודה שלנו הוכיחה כי ניתוח תפוקה גבוהה של כדורי Streptomyces אפשרי באמצעות Copas. ההליך המתואר כאן הוא פשוט, מהיר, ושחזור מאוד. הפרמטר הקריטי שכדאי לזכור בעת הפעולה של המכשיר הוא מהירות הזרימה, שלא תעלה על 100 אירועים / שניות (שלב 3.8 של פרוטוקול זה). אם ריכוז גלולה, ולכן גם את מהירות הזרימה, הופך להיות גבוהים מדי, ערכי TOF יהיו שגו משום שהמכשיר לא מצליח לזהות את כדורים בודדים. מספיק דילול המדגם על ידי התוספת של PBS מתגבר על הבעיה הזו.
מגבלות
שימוש Copas פלוס ד כאן יש קוטר נחיר של 1 מ"מ, אשר מתאים למדידת חלקיקים בגודל שנע 30-700 מיקרומטר. נחיר זה ולכן מאפשר מדידת כדורים שהוקמו על ידי streptomycetes. במקרה של פטריות פילמנטיות מייקר המושבות עשויות להיות גדולות יותר, המגבילה את התחולה הכללית של פלוס Copas. Copas XL יכול למדוד חלקיקים עד 1,500 מיקרומטר בגודל אבל את הרגישות שלו בטווח התחתון של קוטר היא פחות בהשוואה לזה של פלוס Copas. שני פלוס Copas וXL Copas לא יכולים לנתח את החלקיקים קטנים יותר מאשר 30 מיקרומטר. משמעות הדבר הוא כי לא ניתן לנתח נבגים של חיידקים או תאים בודדים. בנוסף, Copas אולי לא במדויק לנתח מצרפים קטנים של נבגים ותאים או מייקר המושבות קטנות מאוד. לשם כך, יש להשתמש בנתחים סלולריים רגילים. מגבלה זו היא להתגבר על ידי Biosorter של איחוד Biometrica, שיכול לנתח את החלקיקים בטווח של 1-1,500 מיקרומטר. הפרס רכישת אולם הוא גבוה יותר.
Copas הוא מכשיר חזק כי הוא קל לתפעול. עם זאת, לפעמים כדורים לא מזוהים לאחר טעינת מדגם לתוך כוס המדגם והחל המדידה. הסיבה היא בדרך כלל צינור הזנה סתום, אשר בקלות יכולה להיפתר על ידי לחיצה על הפקודה "נקייה". זה יאלץ את כדורים בחזרה ממערכת צינורות לתוך כוס המדגם. סיבה אלטרנטיבית יכולה להיות שהמכסה אינה ממוקמת כראוי על כוס המדגם. זה מוביל לירידה בלחץ והכישלון במקביל לאיתור כדורים.
משמעותו וכיוונים עתידיים
אנחנו כאן התמקדנו בניתוח של גודל גלולה אבל התקנת Copas היא גם מסוגלת לנתח וסוג המבוסס על הקרינה וצפיפות. גילוי הקרינה מאפשר לנו לנתח את ביטוי גנים המבוסס על כתבים כגון ה-GFP. יתר על כן, בהרכב של תאים יכול להיות מוערך. אפילו חזק יותר היא האפשרות להפריד בין כדורים לפי parame אלהters. כדורים מסודר יכולים לשמש לניתוחים במורד הזרם, ובכלל זה מחקרים כל omics. ואכן, אנחנו מסודרים בעבר 60,000 כדורים 200,000 קטנים וגדולים, והוכיחו כי proteome הייתה שונה באופן משמעותי בין כדורים קטנים והגדולים 4. טכנולוגיה זו ולכן מספקת מוביל חדש כדי לשפר את streptomycetes כמפעלי תא.
היתרון העיקרי של טכנולוגית Copas הוא זמן. מחקרים קודמים על כדורי תא בוצעו באמצעות מיקרוסקופ, וזה מגביל את מספר כדורים שניתן לנתח עד כמה מאות 16. מחקרים מיקרוסקופית כבר הציעו את קיומם של שתי אוכלוסיות של כדורים בתרבויות Streptomyces-גדל נוזל 16. ואכן, שתי אוכלוסיות של כדורים התגלו ללא קשר לתנאי תרבות במספר גדול של streptomycetes שונה 4. ההטרוגניות גודל זה אינה מוגבל לstreptomycetes פילמנטיות, אך נצפתה גם בפטריות פילמנטיות 12 </ Sup>. בכל המקרים, את המנגנון הבסיסי של הטרוגניות עדיין לא ידוע. האפשרות למיין כדורים לפי גודל וקרינה מאפשרת לנו לפענח מנגנונים כאלה.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Copas PLUS | Union Biometrica | PLUS | Large particle flow cytometer including lasers and software |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | PBS component |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | PBS component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | PBS component |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P9791 | PBS component |
| Difco Yeast Extract | BD Biosciences | 210933 | Media component |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | Media component |
| Oxoid Malt Extract | Fisher Scientific | OXLP0039B | Media component |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | Media component |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Media component |
| MgCl2.6H2O | Sigma Aldrich | M2670 | Media components. Add after autoclaving. |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | F8775 | Fixation of pellets |
| Sodium Hypochlorite Solution | Sigma Aldrich | 71696 | For cleaning of the instrument |
| EtOH | VWR | 20816.367 | For cleaning of the instrument |
| Erlenmeyer Flask (250 ml) | Fisher Scientific | 214-1132 | Culture flask for growing Streptomyces |
| Springs | Verenfabriek De Spiraal | Custom-Made | Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm |
| Sterile Centrifuge Tube (15 ml) | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Syringes (50 ml) | Sigma | Z683698 |
Referenzen
- Hopwood, D. A. . Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).
- van Wezel, G. P., McDowall, K. J. The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances. Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).
- Anné, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. Recombinant protein production and streptomycetes. J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).
- van Veluw, G. J., et al. Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
- Davey, H. M., Winson, M. K. Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).
- Betz, J. W., Aretz, W., Härtel, W. Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs. Cytometry. 5, 145-150 (1984).
- Bell, P. J., et al. A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).
- Pulak, R., Strange, K. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetik. 175, 1505-1531 (2007).
- Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
- de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., Wösten, H. A. B. Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).
- van Veluw, G. J., et al. Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants. Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. . Practical Streptomyces Genetics. , (2000).
- Vinck, A., et al. Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger. Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).
- Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis. Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).
