Sortierung der<em> Streptomyces</em> Zell Pellets mit einem komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter
Summary
Flüssig-grown Streptomyces-Kulturen werden durch Myzelpellets, die in der Größe heterogen sind gekennzeichnet. Wir beschreiben hier eine Methode, um zu analysieren und zu sortieren, wie Pellets in einem Hochdurchsatz-Weise. Diese Pellets können für weitere Analysen, die Leitungen zur Verfügung stellt, zu verstehen und zu steuern Wachstum Heterogenität verwendet werden.
Abstract
Streptomyceten sind filamentöse Bodenbakterien, die in der Industrie zur Herstellung von Enzymen und Antibiotika verwendet werden. Wenn in Bioreaktoren gezüchtet, diese Organismen bilden Netzwerke von miteinander verbundenen Hyphen, als Pellets, die in der Größe heterogen sind bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode, um zu analysieren und sortieren Myzelpellets mit einem komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter (COPAS). Ausführliche Anweisungen für die Verwendung des Instruments und der Grund statistische Analyse der Daten. Wir beschreiben außerdem, wie Pellets können sortiert werden nach benutzerdefinierten Einstellungen, die Weiterverarbeitung ermöglicht, wie die Analyse der RNA-oder Proteingehalt. Mit dieser Methode kann der Mechanismus zugrunde liegende heterogene Wachstum angegangen werden. Dies wird entscheidend für die Verbesserung der Streptomyceten als Zellfabrik, in Anbetracht der Tatsache, dass die Produktivität korreliert mit Pelletgröße sein.
Introduction
Streptomyceten sind filamentöse Bodenbakterien, die für ihre Kenntnisse bekannten Antibiotika bilden, wie auch Verbindungen, die als Immunsuppressiva oder zur Bekämpfung von Pilzinfektionen oder Krebs 1,2 verwendet werden können. Darüber hinaus sind diese Organismen produzieren Enzyme, die für eine Vielzahl von industriellen Anwendungen 3 von Interesse sind. Die meisten kommerziell interessante Verbindungen sind in Bioreaktoren hergestellt. Wachstum von Streptomyceten in Bioreaktoren ist durch die Bildung von komplexen Strukturen von miteinander verbundenen Hyphen, wie Klumpen oder Pellets bekannt ist. Diese multizellulären Strukturen sind sehr heterogen in Bezug auf Größe 4 und Größen, die mehr als eine Million Mal größer als ein einzellige Bakterium wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis sind zu erreichen. Obwohl Heterogenität wird als vorteilhaft Merkmal in natürlichen biologischen Systemen 5 betrachtet, wird es als ein Fallstrick Produktion in der Industrie. BioReaktor Kulturen haben reproduzierbar und kontrollierbar, die eine möglichst hohe Rendite zu erzielen sein. Ein detailliertes Verständnis der Rolle von jedem der Pellet-Typen in einem Bioreaktor ist daher von entscheidender Bedeutung für Streptomyceten als Zellfabrik zu verbessern.
Durchflusszytometrie wird üblicherweise verwendet, um einzelne Zellen untersucht in einer Population 6. Durchflusszytometer kann multiInformationen durch gleichzeitiges Messen von Eigenschaften der Zellen (z. B. Größe, Dichte und multicolor Fluoreszenz) zu erwerben. Auf diese Weise können Zelleigenschaften korreliert werden, um dadurch das Verständnis der Heterogenität in einer Kultur und das Vorhandensein von verschiedenen Populationen von Zellen 6 beiträgt. Spezialisiertere Instrumente entsprechend benutzerdefinierten Parametern machte es möglich, Zellen zu sortieren. Zum Beispiel können Mutanten gescreent werden. Nach der Sortierung können solche mutierten Zellen für die weitere Charakterisierung kultiviert werden. Dies wurde bereits als nützlich erwiesen, unter anderem,zur Verbesserung der Produktivität der Stämme 7,8. Die Düsen Durchflusszytometer typischerweise ermöglichen die Passage von Zellen mit einem maximalen Durchmesser von etwa 10 &mgr; m. Daher können Pellets von Streptomyceten nicht mit regelmäßigen Durchflusszytometer analysiert werden. Sie können jedoch mit der komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter (COPAS) analysiert werden. Wie regelmäßige Durchflusszytometer kann COPAS multi Daten von Teilchen in einem Hochdurchsatz-Art und Weise zu erwerben. Abhängig von der Art der COPAS 10-1,500 &mgr; m große Partikel analysiert werden. Darüber hinaus ermöglicht es für das Sortieren der einzelnen Partikel, die für den Anbau oder Downstream-Analysen verwendet werden können, wie die Isolierung von DNA, RNA oder Proteinen. COPAS wurde zunächst für die Analyse und Sortierung von kleinen mehrzelligen Organismen wie Nematoden Caenorhabditis elegans 9 und Drosophila-Embryonen und Larven 10 ausgebildet. Die Geräte sind auch für Zebrafisch 11 a eingesetztnd für Fadenpilze 12,13. Letztere Organismen bilden auch Myzelpellets, die sogar größer als diejenigen von Fadenbakterien gebildet sind. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Verwendung von COPAS ist auch denkbar Streptomyceten 4. Wir beschreiben hier die experimentelle Verfahren für die Verwendung der COPAS zu Pellet Heterogenität in Streptomyces coelicolor beurteilen, einschließlich Einzelheiten über die Methodik, um Pellets nach Größe zu sortieren. Beachten Sie jedoch, daß dieses Verfahren auch für die Analyse anderer Pellet bildenden Streptomyceten verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durchflusszytometrie hat den Hochgeschwindigkeits-Analyse einer großen Anzahl von Einzelzellen, die zum Verständnis der Heterogenität in klonalen Populationen 6 beigetragen aktiviert. Regelmäßige Durchflusszytometrie nicht möglich ist für die Analyse der vielzelligen Myzelpellets von Streptomyceten und Pilze. Unsere Arbeit hat gezeigt, dass die Hochdurchsatzanalyse von Streptomyces Pellets ist machbar mit COPAS. Das hier beschriebene Verfahren ist einfach, schnell und sehr gut reproduzierbar. Der kritische Parameter zu beachten, während des Betriebs des Gerätes, ist die Strömungsgeschwindigkeit, die 100 Veranstaltungen / sec (Schritt 3.8 dieses Protokolls) nicht überschreiten sollte. Wenn der Pellet-Konzentration und damit auch die Strömungsgeschwindigkeit zu hoch wird, werden die TOF-Werte falsch berechnet werden, da das Gerät nicht zu einzelnen Pellets zu erkennen. Ausreichend Verdünnen der Probe durch Zugabe von PBS überwindet dieses Problem.
Begrenztheit
Die COPAS Plus-Einsatz d hat hier einen Düsendurchmesser von 1 mm, das zum Messen Teilchen mit einer Größe im Bereich von 30 bis 700 &mgr; m ist. Diese Düse ermöglicht daher die Messung Pellets durch Streptomyceten gebildet. Im Fall von filamentösen Pilzen können die Mikrokolonien größer sein, welche die allgemeine Anwendbarkeit des COPAS plus begrenzt. Die COPAS XL können Partikel bis zu 1.500 um Größe zu messen, sondern die Empfindlichkeit im unteren Bereich mit einem Durchmesser von weniger im Vergleich zu dem des Plus-COPAS. Sowohl die Plus-und die COPAS COPAS XL nicht analysieren Teilchen kleiner als 30 um. Dies bedeutet, dass die einzelnen mikrobiellen Sporen oder Zellen können nicht analysiert werden. Darüber hinaus kann die COPAS nicht genau analysieren kleine Aggregate von Zellen oder Sporen und den sehr kleinen Mikrokolonien. Dazu sollten regelmäßige Zellanalysatoren verwendet werden. Diese Einschränkung wird durch die Biosorter der Union Biometrica, die Partikel im Bereich von 1-1,500 um analysieren zu überwinden. Der Kaufpreis ist aber höher.
Die COPAS ist ein robustes Gerät, das einfach zu bedienen ist. Aber manchmal Pellets nicht nach dem Laden einer Probe in die Probenschale und Starten der Messung erfasst. Die Ursache ist in der Regel ein Rohr verstopft Eintrag, die leicht durch Drücken der "sauberen" Befehl gelöst werden können. Dadurch werden die Pellets von dem Rohrsystem zurück in den Probenbecher zu zwingen. Ein alternativer Grund könnte sein, dass der Deckel nicht richtig auf dem Probenbecher gelegt. Dies führt zu Druckverlust und die damit einhergehende fehlende Pellets zu erkennen.
Bedeutung und zukünftige Richtungen
Wir hier konzentrierte sich auf die Analyse der Pellet-Größe, aber die COPAS Setup ist auch in der Lage zu analysieren und auf Fluoreszenz Art und Dichte berechnet. Fluoreszenzdetektion ermöglicht es uns, die Genexpression basierend auf Reporter wie GFP analysieren. Weiterhin kann die Zusammensetzung der Zellen evaluiert werden. Noch leistungsfähiger ist die Möglichkeit, Pellets nach diesen Parameter zu trennenter. Sortiert Pellets können für Downstream-Analysen, einschließlich alle omics-Studien verwendet werden. In der Tat, wir vorher sortiert 60.000 große und 200.000 kleine Pellets, und gezeigt, dass das Proteom war signifikant unterschiedlich zwischen großen und kleinen Pellets 4. Diese Technologie bietet daher neue Leads zu Streptomyceten als Zellfabriken zu verbessern.
Der entscheidende Vorteil des COPAS Technologie ist die Zeit. Frühere Studien an Zellpellets wurden unter Verwendung von Mikroskopie und dadurch die Anzahl von Pellets, die bis zu mehreren hundert 16 analysiert werden können, begrenzt. Mikroskopie Studien, die bereits die Existenz von zwei Populationen von Pellets in flüssigem Streptomyces-Kulturen angebaut 16 vorgeschlagen. In der Tat wurden zwei Populationen von Pellets unabhängig von den Kulturbedingungen in einer großen Anzahl von verschiedenen Streptomyceten 4 erfasst. Diese Größe ist nicht auf Heterogenität Faden Streptomyceten beschränkt, sondern wurde auch in Fadenpilze 12 beobachtet </ Sup>. In allen Fällen werden die zugrunde liegenden Mechanismen der Heterogenität noch nicht bekannt. Die Möglichkeit, Pellets sortieren nach Größe und Fluoreszenz ermöglicht es uns, solche Mechanismen zu entschlüsseln.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Copas PLUS | Union Biometrica | PLUS | Large particle flow cytometer including lasers and software |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | PBS component |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | PBS component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | PBS component |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P9791 | PBS component |
| Difco Yeast Extract | BD Biosciences | 210933 | Media component |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | Media component |
| Oxoid Malt Extract | Fisher Scientific | OXLP0039B | Media component |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | Media component |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Media component |
| MgCl2.6H2O | Sigma Aldrich | M2670 | Media components. Add after autoclaving. |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | F8775 | Fixation of pellets |
| Sodium Hypochlorite Solution | Sigma Aldrich | 71696 | For cleaning of the instrument |
| EtOH | VWR | 20816.367 | For cleaning of the instrument |
| Erlenmeyer Flask (250 ml) | Fisher Scientific | 214-1132 | Culture flask for growing Streptomyces |
| Springs | Verenfabriek De Spiraal | Custom-Made | Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm |
| Sterile Centrifuge Tube (15 ml) | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Syringes (50 ml) | Sigma | Z683698 |
Referenzen
- Hopwood, D. A. . Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).
- van Wezel, G. P., McDowall, K. J. The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances. Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).
- Anné, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. Recombinant protein production and streptomycetes. J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).
- van Veluw, G. J., et al. Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
- Davey, H. M., Winson, M. K. Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).
- Betz, J. W., Aretz, W., Härtel, W. Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs. Cytometry. 5, 145-150 (1984).
- Bell, P. J., et al. A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).
- Pulak, R., Strange, K. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetik. 175, 1505-1531 (2007).
- Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
- de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., Wösten, H. A. B. Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).
- van Veluw, G. J., et al. Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants. Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. . Practical Streptomyces Genetics. , (2000).
- Vinck, A., et al. Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger. Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).
- Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis. Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).
