Total RNA av høy kvalitet er fremstilt fra cellelegemer av musens ryggmargsmotor-nevroner ved laserfangstmikrodisseksjon etter farging av ryggmargsseksjoner med Azure B i 70 % etanol. Tilstrekkelig RNA (~40-60 ng) gjenvinnes fra 3000-4000 motoriske nevroner for å tillate nedstrøms RNA-analyse av RNA-seq og qRT-PCR.
Utarbeidelse av høykvalitets RNA fra celler av interesse er avgjørende for presis og meningsfull analyse av transkripsjonelle forskjeller mellom celletyper eller mellom samme celletype i helse og sykdom eller etter farmakologiske behandlinger. I ryggmargen er slike forberedelser fra motoriske nevroner, målet for interesse for mange nevrologiske og nevrodegenerative sykdommer, komplisert av det faktum at motoriske nevroner representerer <10% av den totale cellepopulasjonen. Laserfangstmikrodisseksjon (LMD) er utviklet for å løse dette problemet. Her beskriver vi en protokoll for raskt å gjenopprette, fryse og seksjonsmus ryggmargen for å unngå RNA-skade ved endogene og eksogene RNases, etterfulgt av farging med Azure B i 70% etanol for å identifisere motornevronene mens du holder endogen RNase hemmet. LMD brukes deretter til å fange de fargede nevronene direkte inn i guanidintiocyanat lysis buffer, opprettholde RNA integritet. Standardteknikker brukes til å gjenopprette den totale RNA og måle integriteten. Dette materialet kan deretter brukes til nedstrømsanalyse av transkripsjonene av RNA-seq og qRT-PCR.
I pattedyrvev som består av flere forskjellige celletyper, har fremkomsten av laserfangst mikrodeseksjon (LMD) instrumentering gitt muligheten til å velge en bestemt celletype for analyse på RNA- eller proteinnivå. For tiden muliggjør forsterkning og neste generasjons sekvenseringsteknikker bruk av et utvalg av total RNA fra noen få tusen celler for å oppnå en relativt grundig oversikt over transkripsjonen, inkludert vurdering av relative nivåer av RNAer og identifisering av ulike skjøtede former. Til dags dato vil proteomikkanalyser av noen få tusen celler nå ned gjennom bare mer tallrike arter. For eksempel har vi identifisert < 1000 av de mest tallrike proteinene fra 3000-4000 motoriske nevroncellelegemer (ikke vist), og Zhu og kolleger har nylig rapportert å identifisere 2665 proteiner fra ~ 15.000 tumorceller1. Med videre utvikling av massespektrometri er det imidlertid sannsynlig at slike analyser vil strekke seg til langt større dybde.
Her presenterer vi en spesifikk protokoll som brukes til LMD av motoriske nevroncellelegemer fra ryggmargen av mus, etterfulgt av forberedelse av RNA. Denne protokollen ble brukt i sammenheng med å sammenligne RNAer fra motoriske nevroner av presymptomatisk transgen mutant superoksid dismutase (SOD)1 amyotrofisk lateral sklerose (ALS) mus med RNAer fremstilt fra en villtype SOD1 transgen stamme av både RNA-seq og qRT-PCR validering2. Spesielt består motornevroner, i det fremre hornet av det grå stoffet i ryggmargen, <10% av den totale cellepopulasjonen, omgitt av et hav av astrocytter, og som sådan kan deres transkripsjonsprofil ikke lett dekonvoluteres fra studier av hele ledningen. En laserfangsttilnærming er dermed ideell for å analysere RNA-uttrykk i disse cellene, med fysiologi bevart ved raskt å utskille og fryse ledningen etter kort intrakariac saltvannsperfusjon. Motor neuron somata er stor og er dermed lett å påvise, her ved hjelp av et fargestoff som har sterk affinitet for nevroner3. I tillegg, med en slik størrelse, gir disse cellene en relativt stor mengde RNA per celle fanget. Prosedyren som brukes, som beskrevet nedenfor, kan enkelt justeres for å oppnå andre nevroncelletyper, samt potensielt andre celletyper, spesielt identifisert enten ved fargestofffargingsteknikker eller ved antistofffarging.
Det viktigste målet på suksess av denne protokollen for å produsere total RNA ved lasermikrodisseksjon av ryggmargsskiver er RIN-verdien5. For RNA-prøver fra høyere eukaryoter gir verdier over 8,5 regelmessig sekvensering av høy kvalitet og qRT-PCR-data. Hvis utbyttet er lavt, men kvaliteten er høy, gjenta preparatet. Hvis integriteten er lavere (til og med 7,5-8), er det imidlertid bedre å finne kilden til problemet og prøve igjen. Det er mange trinn der noe kan gå galt, men egentlig bare to kilder til problemet – endogen RNase forurensning eller eksogen RNase forurensning. Den første kan adresseres av praksis, slik at tiden fra å ofre musen til å fryse O.C.T-innebygd ledning minimeres. Det andre punktet i protokollen der endogen RNase kan bidra til et dårlig resultat er under utarbeidelsen av skivene. Hver skive skal holde seg til en romtemperatur PEN glir raskt, men den vil smelte (O.C.T blir klar). Jo raskere stykket kan bli refrozen jo bedre. Kryostaten vi bruker har flate overflater inne i kammeret som er ved -20 °C, som vi bruker til raskt å fryse skiven på nytt. Finn et lignende sted i kryostaten som brukes, og sørg for at stykket blir ugjennomsiktig igjen raskt.
Det kan være vanskelig å spore opp kilder til eksogen RNase, fordi det er så mange muligheter. De eneste reagensene som brukes som ikke er uttrykkelig RNase-frie, er O.C.T. og Azure B. Hvis Azure B har prestert tilfredsstillende før, kan du prøve en ny flaske O.C.T., selv om dette reagenset aldri har vært et problem. RNase-frie reagenser kan også byttes ut, selv fra en annen leverandør. En mye mer sannsynlig kilde er etterforskeren. I tillegg til en grundig opprydding av arbeidsområdet, er det ofte nyttig å få et annet labmedlem til å følge med og observere alle trinnene i prosedyren. Selv om dette er noen som ikke rutinemessig utfører denne prosedyren, kan et nytt sett med øyne plukke opp en ellers ubemerket forurensningskilde.
Å utvide denne protokollen til å gjenopprette RNA fra andre ryggmargsceller, fra ryggmargsceller fra andre arter, eller fra bestemte celletyper i andre organer, vil kreve modifikasjoner på flere områder rettet mot å oppnå klar identifisering av cellene av interesse mens du obviating, eller i det minste minimere, virkningen av endogen RNase. I protokollen her tillot rask fjerning og frysing av ledningen, kombinert med Azure B-farging i 70% etanol, både minimering av RNA-nedbrytning og enkel identifisering av motoriske nevroncellelegemer. Azure B er en veletablert histokjemisk flekk for nevroner som ser ut til å binde seg til RNA3 og har blitt brukt til å evaluere RNA-innhold av nevroner i obduksjonsprøver av hjernevev fra pasienter med nevrodegenerativ sykdom6. Spesielt påvirket ikke Azure B-farging verken integriteten til den rensede RNA eller dens evne til å bli omvendt transkribert og analysert. Andre fargestoffer, som cresylfiolett7 og toluidinblå8, har blitt brukt i lignende LMD-protokoller. Å samle cellelegemene direkte inn i guanidintiocyanatløsningen da de ble dissekert, ga det siste trinnet som resulterte i rutinemessig gjenoppretting av intakt RNA.
Lignende tilnærminger kan ses for seg for andre celler og organer, og erkjenner at det å identifisere cellene av interesse mens du minimerer eller helst forhindrer RNA-nedbrytning av endogene RNases er det kritiske kravet for vellykket analyse. I vev som har høye nivåer av RNase, som bukspyttkjertelen, har rask håndtering og lav temperatur blitt kombinert for å tillate utvinning av RNA fra β celler, og dra nytte av deres naturlige autofluorescence for visualisering9. Prosedyrer som bruker antistofffarging for identifisering er også rapportert10, men har ikke vært fullt vellykket i våre hender. Til slutt er mange musemodeller tilgjengelige som uttrykker fluorescerende fusjonsproteiner (dvs. GFP, YFP, RFP) i celler av interesse, som kan brukes til å identifisere dem i vevsseksjoner på LMD-mikroskopet. Faktisk uttrykker musestammene vi har analysert med denne protokollen et fusjonsprotein mellom SOD1 og YFP11, og deres ryggmargsmotoriske nevroner er svært fluorescerende. Vi var imidlertid ikke i stand til å finne et sett med etanolvasker og / eller dehydreringsforhold som samtidig ville fjerne O.C.T., hemme RNase-aktivitet og konsekvent opprettholde tilstrekkelig YFP-fluorescens for å tillate visualisering av motornevronene og deres gjenoppretting av LMD. Kanskje et nytt fluorescerende protein eller en variant av de tilgjengelige som opprettholder fluorescens i organiske løsningsmidler, kan bli funnet for å overvinne denne begrensningen.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke George Farr og medlemmer av Horwich lab for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av Howard Hughes Medical Institute.
Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |