क्रोनिक EAE के साथ चूहों में तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के प्रणालीगत इंजेक्शन
Summary
तंत्रिका स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NPCs) के प्रत्यारोपण पुनर्योजी न्यूरोलॉजी में महान वादे रखती है. NPCs की प्रणालीगत प्रसव के दिमाग और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की प्रयोगात्मक जीर्ण सूजन क्षति से प्रभावित rodents और nonhuman primates की रीढ़ की हड्डी में स्टेम कोशिकाओं को वितरित करने के लिए प्रभावी, आक्रामक कम, और therapeutically बहुत प्रभावशाली प्रोटोकॉल में बदल गया है.
Abstract
तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (NPCs) पुनर्योजी न्यूरोलॉजी में मस्तिष्क की मरम्मत या बहाली पर निशाना प्रत्यारोपण के तरीकों के लिए एक आशाजनक स्टेम सेल के स्रोत हैं. इस निर्देश के मस्तिष्क की मरम्मत मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के कई preclinical मॉडल में फोकल या प्रणालीगत एनपीसी प्रत्यारोपण के बाद हासिल की है कि व्यापक सबूत से उत्पन्न हो गई है.
इन प्रयोगात्मक डेटा तत्काल मूल्यांकन की आवश्यकता है कि मस्तिष्क की बीमारियों के लिए दृढ स्टेम सेल उपचार की मुख्य बाधाओं में से एक के रूप में सेल वितरण मार्ग की पहचान की है. Intraparenchymal स्टेम सेल ग्राफ्टिंग ऐसे रीढ़ की हड्डी की चोट और पार्किंसंस रोग के रूप में अलग और सुलभ मस्तिष्क घावों की विशेषता उन विकृतियों को एक तार्किक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है. दुर्भाग्य से, इस सिद्धांत मल्टिपल स्क्लेरोसिस (एमएस) सहित एक, Multifocal भड़काऊ और (समय में और अंतरिक्ष दोनों) फैलाया प्रकृति की विशेषता शर्तों को खराब लागू है. इस तरह, मस्तिष्क syst द्वारा लक्षित कर के रूप मेंEMIC एनपीसी वितरण दिमाग और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की प्रयोगात्मक जीर्ण सूजन क्षति से प्रभावित rodents और nonhuman primates की रीढ़ की हड्डी के लिए कोशिकाओं को वितरित करने के लिए एक कम आक्रामक और therapeutically प्रभावोत्पादक प्रोटोकॉल बन गया है.
सेल वितरण के इस वैकल्पिक विधि, एनपीसी pathotropism पर (मैं) कार्यात्मक सेल आसंजन अणुओं और भड़काऊ cytokine और केमोकाइन रिसेप्टर्स के माध्यम से पर्यावरण भावना को विशेष रूप से उनके जन्मजात क्षमता निर्भर करता है; (द्वितीय) में रिसाव संरचनात्मक नसों के बाद बाधाओं (. चतुर्थ) या intracerebroventricular (आईसीवी) इंजेक्शन पार; (Iii) भड़काऊ मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को नुकसान के कई परिवाहकीय साइट (ओं) के स्तर पर जमा; और (iv) विवो में अलग मेजबान लक्ष्य कोशिकाओं पर उल्लेखनीय ऊतक पौष्टिकता और प्रतिरक्षा विनियामक प्रभाव डालती है.
यहाँ हम हम चतुर्थ के लिए विकसित किया है कि विधियों का वर्णन. और <उन्हें> आईसीवी पुरानी सीएनएस भड़काऊ demyelination के मॉडल के रूप में प्रयोगात्मक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) के साथ चूहों में syngeneic NPCs के वितरण, और पुनर्योजी न्यूरोलॉजी में सूजन मस्तिष्क के चुनिंदा लक्ष्यीकरण के लिए एक मूल्यवान तकनीक के रूप में प्रणालीगत स्टेम सेल प्रसव की परिकल्पना की गई.
Introduction
पुख्ता सबूत सीएनएस विकारों 1-8 के पशु मॉडल में दैहिक तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (NPCs) के प्रत्यारोपण के चिकित्सीय प्रभावकारिता के लिए attesting vivo अध्ययन में से उत्पन्न हो गई है. इन प्रयोगात्मक परिणामों नैदानिक अनुप्रयोगों में अनुवाद किया जा सकता से पहले फिर भी, मेजबान में स्टेम कोशिकाओं के वितरण से संबंधित मुद्दों का एक नंबर सावधानी से विचार करने की आवश्यकता है. Multifocal, जीर्ण सूजन मस्तिष्क रोगों के लिए (nonhematopoietic) दृढ स्टेम सेल के उपचारों के विकास की दिशा में एक विशेष रूप से पर्याप्त बाधा एनपीसी इंजेक्शन का आदर्श मार्ग की पहचान है. लक्षित बीमारी के pathophysiology की एक फर्म को समझने (फोकल या Multifocal, प्राथमिक भड़काऊ या प्राथमिक अपक्षयी), और वितरण तकनीकों के साथ जुड़े व्यवहार्यता और जोखिम मुद्दों के एक सतर्क विश्लेषण स्टेम सेल प्रसव के लिए इष्टतम प्रोटोकॉल की पहचान करने में कर रहे हैं.
जबकि केन्द्र ( <em> जैसे. तंत्रिका तंत्र पैरेन्काइमा में) स्टेम सेल प्रत्यारोपण क्षति के स्थानिक सीमित क्षेत्रों की विशेषता सीएनएस रोगों के उपचार के लिए एक तार्किक दृष्टिकोण है (जैसे पार्किन्सन और हंटिंगटन रोग, मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की दर्दनाक चोटों, और स्ट्रोक), बहुत ही दृष्टिकोण साबित हो सकता है इस तरह के एक, Multifocal पुरानी, और स्थानिक फैलाया सीएनएस क्षति समय के साथ जम जाता है जहां एमएस, जैसी स्थितियों में व्यावहारिक रूप से संभव नहीं हो. इस उत्तरार्द्ध मामले में, व्यक्तिगत घावों को फोकल सेल इंजेक्शन लक्षित कर भी इस तरह कम आक्रामक एनपीसी प्रत्यारोपण के साथ लक्षित सीएनएस के विकल्प, अधिक उपयुक्त तरीकों की पहचान उत्साह, सीएनएस पैरेन्काइमा भीतर लंबी दूरी पर विस्थापित करने के लिए प्रतिरोपित NPCs की सीमित क्षमता द्वारा बाधा है .
CNS9 बाहर intravascularly जब इंजेक्शन महान वादा चूहों में NPCs एक intracranial ट्यूमर (जैसे. Glioma) लक्ष्य है कि टिप्पणियों से उभरा. इस मौलिक के बादस्टेम सेल pathotrophism 10 की विवो साक्ष्य के रूप में, व्यापक डाटा, प्रयोगात्मक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) के साथ प्रयोगशाला पशुओं में व्यवहार्यता और NPCs के प्रणालीगत प्रत्यारोपण के चिकित्सीय प्रभावकारिता से संबंधित जमा किया गया है नसों में या तो के माध्यम से भड़काऊ सीएनएस नुकसान की एक मॉडल के रूप में (चतुर्थ) या intracerebroventricular (आईसीवी.) एनपीसी इंजेक्शन 1,2,5,6,8 .. हम पहली बार इस लक्ष्य और दर्ज सूजन सीएनएस, और बाद में कई कहनेवाला संलग्न करने के लिए प्रतिरोपित NPCs की क्षमता पर निर्भर है पता चला है कि विवो 11 में विशिष्ट microenvironments भीतर संचार कार्यक्रम. विशेष रूप से सीएनएस को लक्षित करने के लिए, NPCs मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) ICV इंजेक्शन द्वारा परिसंचरण, या चतुर्थ इंजेक्शन के माध्यम से खून में सीधे वितरित कर रहे हैं. एक बार जब खून या सीएसएफ या तो प्रवेश, प्रत्यारोपित NPCs सक्रिय रूप से बातचीतरक्त मस्तिष्क (BBB) या रक्त मस्तिष्कमेरु द्रव (BCSFB) बाधाओं और सीएनएस पैरेन्काइमा दर्ज करें. एनपीसी भ्रष्टाचार और बीबीबी (या BCSFB) के बीच यह बातचीत एनपीसी सतह सेल आसंजन अणुओं (CAMs) के विशिष्ट सेट द्वारा विनियमित और सक्रिय endothelial / ependymal कोशिकाओं 12-14 पर सीएएम जवाबी ligands के उच्च स्तर की अभिव्यक्ति से मदद की है. इन cams के उदाहरण Hyaluronate के लिए रिसेप्टर, CD44, और कहनेवाला आसंजन अणु (ICAM) -1 ligand बहुत देर प्रतिजन (VLA) -4 5,15,16 (कि, leukocytes में, सक्रिय ependymal के साथ बातचीत के जिम्मेदार हैं शामिल और endothelial कोशिकाओं), और एक बहुत कम हद लिम्फोसाइट समारोह जुड़े प्रतिजन (LFA) -1 और पी selectin ग्लाइकोप्रोटीन ligand (PSGL) -1 के लिए. NPCs भी CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, और CXCR4 सहित केमोकाइन रिसेप्टर्स की एक विस्तृत श्रृंखला, एक्सप्रेस (लेकिन CCR3 और CCR7 व्यक्त नहीं है) इन विट्रो और इन विवो 5,16, दोनों में कार्यात्मक रूप से सक्रिय हैं, जो. इस प्रकार, systemically इंजेक्शन NPCs सूजन सीएनएस के स्तर पर जमा करने के लिए, जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCRs) के साथ साथ, इन cams का उपयोग करें. इसके विपरीत, NPCs नाड़ी या मस्तिष्कमेरु द्रव अंतरिक्ष मार्गों 2 के माध्यम से सीएनएस में प्रवेश नहीं करते स्वस्थ चूहों में प्रणालीबद्ध इंजेक्शन. रासायनिक प्रेरित इन्सेफेलाइटिस की एक मॉडल के रूप में प्रणालीगत साइटोकाइन या lypopolisaccharide (LPS) इंजेक्शन के बाद सीएनएस सूजन, या endothelial / ependymal सेल सक्रियण, मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी 2 में प्रणालीबद्ध इंजेक्शन NPCs के संचय के लिए आवश्यक है. इस प्रकार, प्रणालीगत एनपीसी चिकित्सा के साथ सीएनएस के सफल लक्ष्यीकरण मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में पर्यावरण के संचय और NPCs के transendothelial प्रवास के लिए अनुकूल हैं, जिनमें अवसर (वू) की एक बीमारी विशिष्ट खिड़की की पहचान पर निर्भर है. ऐसी स्थिति में आम तौर पर तीव्र और subacute सूजन 17 के संदर्भ में उत्पन्न होती हैं. एक बार अविभाजित NPCs प्रतिरोपित, सीएनएस में प्रवेश करने केचूहों के Clinico रोग सुविधाओं के साथ ही EAE साथ बड़ा, nonhuman primates उन्नति दिखाया गया है. इस के जवाब में न्यूनतम सेल प्रतिस्थापन 2 और गैर सीएनएस सूजन क्षेत्रों 19,20 (जैसे लिम्फ नोड्स) बनाम परिवाहकीय सीएनएस 2,5,6,18 भीतर प्रतिरक्षा विनियामक और न्यूरोप्रोटेक्टिव पैराक्राइन कारकों की उल्लेखनीय स्राव से निर्भर होना बताया गया है भड़काऊ संकेतन सेल प्रतिरक्षा कोशिकाओं 5 घुसपैठ से हासिल.
इस के साथ साथ हम पुरानी EAE के एक माउस मॉडल में दैहिक NPCs के प्रणालीगत इंजेक्शन के प्रमुख methodological पहलुओं का वर्णन. अधिक विशेष रूप से, हम विस्तार और वयस्क C57BL 6 / चूहों की subventricular क्षेत्र (SVZ) से प्रत्यारोपण दैहिक NPCs के लिए तैयार है, हम (मैं) की स्थापना की है कि प्रोटोकॉल प्राप्त परिभाषित; (Ii) ऐसे चूहों में पुरानी EAE प्रेरित और (iii) therapeutically प्रभावोत्पादक प्रणालीगत (चतुर्थ या आईसीवी) एनपीसी प्रत्यारोपण प्रदर्शन मैंNto EAE चूहों.
Protocol
Representative Results
Discussion
दैहिक स्टेम सेल आधारित चिकित्सा ऐसे MS2 11 के रूप में जीर्ण सूजन सीएनएस विकारों के इलाज के लिए सबसे होनहार रणनीतियों में से एक के रूप में उभर रहे हैं. उनके उपचारात्मक प्रभाव को बनाए रखने के लिए तंत्र अभ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों समीक्षकों पांडुलिपि की समीक्षा करने और सबूत के संपादन के लिए Jayden स्मिथ धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी (NMSs, आंशिक अनुदान आरजी-4001-A1) से समर्थन प्राप्त हुआ है, इतालवी मल्टीपल स्केलेरोसिस एसोसिएशन (AISM, 2010/R/31 दे सकते), इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (GR08-7), जीवन, बैंका Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) ईआरसी-2010-STG अनुदान समझौते के तहत कोई 260,511-SEM_SEM और यूरोपीय समुदाय (ईसी) 7 फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) के लिए पंख अनुदान करार n * डिग्री के नीचे; 280772 – Ione.
Materials
| Cell culture | |||
| EBSS | Sigma | E2888 | |
| L-Cystein | SIGMA-ALDRICH CO LTD | C7352 | |
| Papain | WORTHINGTON | 30H11965 | |
| EDTA | Fisher scientific | D/0700/50 | |
| Mouse NeuroCult basal medium | Stem Cell technologies | 05700 | |
| NeuroCult proliferation supplements | Stem Cell technologies | 05701 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B-1000 | |
| Epidermal growth factor | Peprotech | AF-100-15-1000 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 1514012 | |
| Matrigel (coating solution) | BD biosciences | 354230 | |
| NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) | Stem cell technologies | 05704 | |
| Accumax | eBioscience | 00-4666-56 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca& Mg | PAA LABORATORIES LTD | H15-011 | |
| Myco trace | PAA LABORATORIES LTD | Q052-020 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | |
| immunofluorescence | |||
| Normal goat serum | PAA LABORATORIES LTD | B11-035 | |
| Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether | SIGMA-ALDRICH CO LTD | T8787 | |
| Mouse anti Nestin | Abcam | ab11306 | |
| Rabbit anti GFAP | DAKO | 203344 | |
| Mouse anti Histone H3 (phospho S10) | Abcam | ab14955 | |
| Rabbit anti MAP-2 | Abcam | ab32454 | |
| Rat anti MBP | AbD SEROTEC | MCA409S | |
| Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 | Millipore | MAB345 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting solution | DAKO | S3023 | |
| EAE | |||
| Freund's Adjuvant Incomplete | SIGMA-ALDRICH CO LTD | F5506 | |
| Mycobacterium tuberculosis | DIFCO | H37Ra | |
| MOG(35–55) | Espikem | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories | 181 | |
| Tissue processing | |||
| Iris scissor straight | Fine Sciences Tolls | 14060-09 | |
| Blunt/bended forceps | Fine Sciences Tolls | 11080-02 | |
| Brain slicer | Zivic instruments | BSMAS005-1 | |
| Surgical blades | Swann-Morton | 324 | |
| P200, P1000 pipettes | |||
| Ketamine (Vetalar) | Boehringer Ingelheim | 01LC0030 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 32371 | |
| Stereotaxic frame | KOPF | Model 900 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7762-04 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SIGMA | 158127 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | vector laboratories | PK-6100 |
Referenzen
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