형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

1. 재조합 벡터 만들기 N-또는 C-말단이 관심의 바이러스 유전자를 라벨에 기르는 데 필요한 150bp 길이의 상동성 영역(왼쪽 및 오른쪽 팔이라고 함)을 식별합니다(그림 1b참조). 선택의 제한 부위에 의해 분리된 150 bp 좌우 팔을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 설계한다. 이 전체 시퀀스는 또한 두 번째 제한 사이트 쌍(첫 번째 쌍과 다른)에 의해 측면에 있어야 만 한 번 합성된 TDS 벡터에 통합할 수 있습니다. 서열이 원하는 삽입 부위와 프레임에 있는 제한 부위로 올리고뉴클레오티드를 설계할 때 주의하십시오. 합성을 위해 올리고뉴클레오티드를 설계할 때 왼쪽팔과 오른쪽 팔 사이에 제한 부위를 통합하면, 이는 선택의 형광 태그의 열린 판독 프레임을 측면으로 하는 것과 일치해야 한다(도 1b참조). TI 제한 부위를 왼쪽 팔과 형광 태그의 시작 사이에 3개의 아미노산 링커로 사용할 수 있다. PCR에 의해 형광 태그의 양쪽에 이러한 동일한 제한 사이트를 통합합니다(그림 1c참조). 합성된 조각을 TDS 벡터로 복제합니다. 형광 태그를 상동성의 왼쪽 및 오른팔 영역 사이의 제한 부위를 사용하여 결과 재조합 벡터로 복제합니다(그림 1d참조). 2. 재조합 바이러스 생성 도 2에따라, 감염의 복합성(MOI)> 1에서 혈청이 없는 매체에서 백시니아 바이러스를 가진 BS-C-1 세포의 단층을 감염한다. 1 시간 감염 후, 덜벡코의 수정 독수리 매체 (DMEM)와 구조 세포 (DMEM) 및 혈청없는 매체에서 3 :1의 비율로 재조합 벡터 플라스미드 및 경질 시약의 혼합물과 트랜스펙트. 24 시간 후에, 태아 소 혈청 (FBS)를 포함하는 DMEM에 있는 세포를 긁어 내고 복구하고 열린 세포를 끊고 바이러스 입자를 풀어 놓기 위하여 3개의 동결 해동 주기를 능력을 발휘합니다. 10% FBS DMEM 및 GPT 선택 시약 마이코페놀산(25 μg/ml) 및 크산틴(250 μg/ml)의 액체 오버레이로 플라크 분석작업을 수행합니다. BS-C-1 세포의 단층으로 6웰 플레이트를 시드합니다. 개별 플라크의 적절한 분리를 보장하기 위해 바이러스 입자를 포함하는 동결 해동 세포의 직렬 희석으로 100 % 컨웰릭 셀 단층층을 감염시킵니다. GPT 선택 시약을 함유한 DMEM을 함유한 액체 10% FBS오버레이- 진협산과 산틴은 각각 25μg/ml 및 250 μg/ml의 최종 농도로. 24 시간 인큐베이션 후, 액체 오버레이를 제거하고 형광 현미경을 사용하여 TDS 벡터에서 바이러스로 mCherry를 통합하는 데 해당하는 확산 적색 형광을 나타내는 플라크를 찾습니다. 표적 유전자 및 선택된 형광 태그에 따라 태그된 유전자의 국소형 형광도 동일한 적색 플라크에서 관찰될 수 있다. 피펫 팁으로 스크래핑을 하고 DMEM을 포함하는 5% FBS의 100 μl을 사용하여 각 재조합 바이러스에 대해 여러 플라크를 선택하고, 스크랩된 세포의 3라운드가 재조합 바이러스를 방출합니다. 성장 매체에서 GPT 선택 시약으로 재조합 바이러스를 증폭시키기 위해 12웰 플레이트의 세포의 단층층에 동결 해동 바이러스를 함유한 DMEM을 추가한다. 성공적인 증폭을 긁어 24 시간 감염. 붉은 형광을 나타내는 성공적으로 증폭 된 플라크의 플라크 분석, 다음과 같이 아가로즈 오버레이 및 GPT 선택이 이번에는 다음과 같이 수행하십시오. BS-C-1 세포의 단층으로 6웰 플레이트를 시드합니다. 재조합 바이러스의 직렬 희석을 수행하고 FBS 무료 DMEM에서 바이러스의 희석이 증가함에 따라 우물을 감염시. 1 시간 감염 후, 액체 매체를 제거하고 2.5 % FBS, 292 μg / ml L-글루타민, 100 U / ml 페니실린 및 100 μg / ml 연쇄 상감 시술을 포함하는 최소 필수 매체 (MEM)에서 0.5 % 아가로즈로 각각 잘 오버레이하십시오. 감염 후 2-3일, GPT 선택 없이, 이번에는 다시 증폭하기 위해 빨간색과 선택한 형광태그의 색을 표시하는 플라크를 선택한다. 선택 없이 아가로즈 오버레이로 다음 플라크 분석작업을 수행합니다. 확산적 적색 형광을 잃어버린 플라크를 선택하지만 선택한 태그에 해당하는 국소형 형광을 유지합니다. mCherry 및 gpt 선택 유전자를 잃었지만 선택한 태그에 대응하는 국소형 형광을 유지한 재조합 바이러스의 순수한 재고를 얻기 위해 선택없이 플라크 정화를 계속합니다. 확인 주식은 플라크 분석에 의해 순수, 모든 플라크는 유사한 플라크 표현형을 가져야한다. 바이러스 성 주식이 순수하도록 유전체 DNA의 PCR 검사를 사용합니다. 삽입된 형광 유전자 자체를 증폭시키는 형광 유전자 삽입 부위및 프라이머를 측면에 있는 프라이머를 설계합니다. 이 프라이머의 다른 조합은 유전자 삽입을 검출하고 순도를 나타내는 PCR 앰플리턴을 생성합니다. BS-C-1 세포의 12웰 플레이트 단층의 한 우물에서 PCR을 선별하는 바이러스 성 주식을 증폭시한다. 감염 후 24시간, 감염된 세포를 DMEM의 250 μl로 긁어냅니다. 원심분리기 감염 세포(10분 당 18,000 x g, 4°C), 슈퍼나탄을 제거하고 500 μl TE(10m Tris-HCl 및 1mMM EDTA, pH 8)에서 세포 펠릿을 0.1%(v/v) SDS로 제거한다. 세포를 lyse 소용돌이. 500 μl 페놀-클로로폼-이소아밀 아코홀을 넣고 섞어 넣습니다. 원심분리기 (4 분, 4 °C에 대한 18,000 x g). 상체를 가지고 반복합니다. 1 ml 100% 에탄올(냉장) 및 50 μl 나트륨 아세테이트를 추가하여 상수에 에탄올 침전을 수행하여 혼합을 반전시합니다. 하룻밤 -20 °C 또는 -80 °C에서 1 시간 동안 둡니다. 원심분리기(30분 동안 18,000xg, 4°C)는 모든 액체를 제거하고 침전된 DNA를 공기 건조시킬 수 있도록 합니다. 50 μl TE로 다시 중단합니다. 게놈 DNA PCR 스크리닝을 위한 템플릿으로 이것을 사용하십시오. 3. 하나 이상의 태그를 들고 재조합 바이러스의 세대 형광 재조합 바이러스와 동일한 세포 단층을 코감염하여 프로토콜 1)에서 이중 또는 삼중 표지 바이러스를 만들거나 다른 태그로 반복 절차를 만듭니다. 바이러스의 플라크 표현형 또는 PCR 스크리닝에 기초하여 바이러스를 정화하여 게놈 DNA를 분리합니다.