JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie und Infektion

منهجية لتوليد كفاءة من البروتينات فيروس Vaccinia الموسومة الفلورية

Published: January 17, 2014
doi:
10.3791/51151
, , , , ,
1School of Molecular Bioscience,University of Sydney, 2Department of Medicine,Center for Vascular Research, 3Asia Pacific Centre for Animal Health, Faculty of Veterinary Science,University of Melbourne

Summary

ويرد هنا وصف بروتوكول سريع ووحدات لتوليد فيروسات vaccinia المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات الموسومة الفلورية في وقت واحد باستخدام طريقة الاختيار المهيمن العابر.

Abstract

وقد ثبت وضع علامات على البروتينات الفيروسية مع البروتينات الفلورية نهجا لا غنى عنه لتعزيز فهمنا للتفاعلات بين الفيروس والمضيف. فيروس Vaccinia (VACV) ، وهو اللقاح الحي المستخدم في القضاء على الجدري ، قابل بشكل خاص للفحص المجهري للخلايا الحية الفلورية بسبب حجمه الكبير Virion وسهولة هندسته على مستوى الجينوم. نحن هنا تقرير بروتوكول الأمثل لتوليد الفيروسات المؤتلفة. تم تحديد الحد الأدنى من متطلبات إعادة التركيب المتجانس المستهدف أثناء تكرار ال vaccinia ، مما يسمح بتبسيط توليد البناء. وقد مكن ذلك تحالف الاختيار المهيمن العابر (TDS) مع مراسل فلوري واختيار التمثيل الغذائي لتوفير نهج سريع ونمطي لتسمية البروتينات الفيروسية الفلورية. من خلال تبسيط جيل من الفيروسات المؤتلفة الفلورية، ونحن قادرون على تسهيل التطبيقات المصب مثل تحليل التصوير المتقدمة من جوانب كثيرة من التفاعل الفيروس المضيف الذي يحدث أثناء تكرار الفيروس.

Introduction

Vaccinia virus (VACV) هو فيروس الجدري الأولي ويرتبط ارتباطا وثيقا بفيروس فاريولا ، العامل المسبب للجدري. كل من هذه الفيروسات هي أعضاء في جنس جدري العظام التي تشمل مسببات الأمراض البارزة الأخرى مثل جدري القردة وفيروس ectromelia (جدري الماء)1. فيروسات العظام لديها جينوم الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل كبيرة (180-220 kb) التي ترميز ما يزيد على 200 إطارات القراءة المفتوحةالمتوقعة 2،3. تكرار هذه الفيروسات ينطوي على تشكيل مصنع فيروسات ما حول النووية، حيث يتم إجراء الفيروسات الناضجة (MV)، وشبكة عبر غولجي حيث مجموعة فرعية من MV الحصول على اثنين من الأغشية الإضافية لتوليد الفيروسات ملفوفة (WV) (استعرضت من قبل روبرتس وسميث4). الجينوم جدري العظام قابلة للغاية للتلاعب الجيني بسبب درجة عالية من إعادة التركيب الجيني الذي هو سمة من سمات تكرار الجينوم VACV ويتم بوساطة بوليمرات الحمض النووي الفيروسي5. توليد الفيروسات المؤتلفة يعتمد على إعادة التركيب متجانسة وجزيئات الحمض النووي الخطي مع التجانس صغيرة مثل 12 نقطة أساس كافية للتوسط في إعادة التركيب في الخلايا المصابة بفيروس vaccinia6. يمكن وضع العلامات الفلورية من فيروس vaccinia تسفر عن جزيئات الفيروس مشرق للغاية بسبب الحجم الكبير من جزيئات جدري العظام، والذي يسمح لدمج العديد من البروتينات الفلورية لكل virion7. Vaccinia لديه القدرة على حمل شظايا كبيرة من الحمض النووي الأجنبي8 وعلاوة على ذلك، فإن عدم وجود التماثل capsid جامدة قد تسمح بدرجة من المرونة عند التعبير عن الانصهار الجيني البروتين الفيروسي من lociالذاتية 9. وقد ثبت وضع علامات الفلورسنت من البروتينات VACV لا تقدر بثمن لدراسة التفاعلات المضيفة الممرضة على المستوى دون الخلوي، لا سيما في مجال دخول الفيروس10،ونقل11-13،و morphogenesis، لا سيما من virionsملفوفة 7.

يمكن اختيار الفيروسات المؤتلفة عن طريق إنقاذ النمط الظاهري للنمو الموهن14،15، اختيار الأيض16-18، أو عن طريق التعبير عن جين علامة(على سبيل المثال X-gal19 أو البروتين الفلوري13،20). هنا نحن نصف اختيار الفيروسات الفلورية باستخدام مزيج قوي من الفلورسنت واختيار الأيض. العابرة المهيمنة اختيار (TDS) ناقلات, التي وضعتها فوكنر وموس (1990)21, تسمح علامات أن تكون متكاملة جنبا إلى جنب مع الجين الموسومة الفلورسنت المطلوب من الفائدة. عند إزالة الاختيار الأيضي ، يمكن أن يحدث حدث إعادة دمج ثانوي يقوم باختزال جينات الاختيار ، ولكنه يترك بروتين الفيروس الموسوم بالفلورسنت سليما. ويقدم الشكل 2 أدناه لمحة عامة عن الإجراء التجريبي. جينات الاختيار المستخدمة في هذه الدراسة هي mCherry وEscherichia coli guanine الفوسفوريسيل ترانسفيراز(gpt)الجين، وكلاهما أعرب من الاصطناعية في وقت مبكر / في وقت متأخر المروج الفيروسية وتستخدم سابقا من قبل كورديرو وآخرون. 22 بالإضافة إلى ذلك ، هناك مضان من بروتين الانصهار الموسومة ذات الاهتمام. عند إزالة الاختيار الأيضي ، يتم استئصال العلامات القابلة للاختيار(mCherry و gpt)، مما يترك فقط مضان الجين الموسوم ، مما يسمح بتحديد الفيروسات المؤتلفة الصحيحة. يوفر استئصال علامات الاختيار إمكانية الجمع بين علامات الفلورسنت المتعددة ، مما يمكننا من إنشاء فيروسات مع القدرة على تسمية العديد من البروتينات الفيروسية في وقت واحد. وقد حددت الدراسات السابقة الحد الأدنى من متطلبات التشوه ل vaccinia إعادة دمج جزيئات الحمض النووي الخطية والتعميمية التي تم تحويلها إلى خلايا مصابة بفيروس vaccinia6. أردنا تحديد كفاءة إعادة التركيب من أطوال التشوم متفاوتة من الأسلحة المحيطة في ناقلات TDS gpt-mCherry من خلال دمجها في الجينوم الفيروسي vaccinia. وتقرر أن المناطق المتجانسة من 100 نقطة أساس في ناقلات TDS كافية لاستهداف والتوسط في إدراج الحمض النووي المؤتلف في جينوم VACV عن طريق إعادة التركيب المتجانس(الشكل 4). في حين أن أطوال التماثل الأصغر ستمكن أيضا من إعادة التركيب ، فإن أطوال 100 bp homology قدمت ما يكفي من الفيروسات المؤتلفة التي يمكن التعرف عليها بسهولة مع اختيار الأيض والفلورسنت. ويمكن توليف أجزاء الحمض النووي من هذا الحجم تجاريا بتكلفة منخفضة نسبيا ويسهل إلى حد كبير إنتاج ناقلات متعددة لإنشاء الفيروسات المؤتلفة. اخترنا زيادة طول التماثل إلى 150 نقطة أساس لتوفير تردد أكبر لإعادة التركيب مع الحفاظ على انخفاض تكاليف تركيب تسلسل أوليغونوكليوتيد من المناطق المحيطة.

Protocol

1. إنشاء متجه إعادة التركيب تحديد مناطق 150 bp طويلة من homology (يشار إليها باسم الذراعين الأيسر والأيمن) المطلوبة لتسمية N- أو C-terminally الجين الفيروسي من الفائدة (انظر الشكل 1ب). تصميم تسلسل oligonucleotide تتألف من 150 نقطة أساس الذراعين اليسار واليمين مفصولة زوج من مواقع تقييد الاختيار. يجب أن يحيط هذا التسلسل بأكمله أيضا بزوج ثان من مواقع التقييد (مختلفة عن الزوج الأول) للسماح بالإدماج في ناقل TDS بمجرد توليفه. الحرص عند تصميم oligonucleotide مع تقييد المواقع التي تسلسل في إطار مع موقع الإدراج المطلوب. دمج مواقع تقييد بين الذراعين الأيسر والأيمان عند تصميم oligonucleotide للتوليف، والتي يجب أن تتطابق مع تلك التي تحيط إطار القراءة المفتوحة من العلامة الفلورية للاختيار (انظر الشكل 1ب). فمن الممكن استخدام موقع تقييد نوتي باعتبارها الرابط الأحماض الأمينية الثلاثة بين الذراع اليسرى وبداية العلامة الفلورسنت. دمج هذه المواقع تقييد نفسه على جانبي العلامة الفلورسنت بواسطة PCR (انظر الشكل 1c). استنساخ جزء توليفها في ناقلات TDS. استنساخ العلامة الفلورية في ناقلات إعادة التركيب الناتجة باستخدام مواقع التقييد بين مناطق الذراع الأيسر والأيمن من علم الأوهام (انظر الشكل 1D). 2. إعادة دمج جيل الفيروسات وفقا لل الشكل 2، تصيب طبقة أحادية من خلايا BS-C-1 بفيروس vaccinia في الوسائط الخالية من المصل في تعدد العدوى (MOI) > 1. 1 ساعة بعد العدوى، وخلايا الإنقاذ مع دولبيكو متوسط النسر المعدلة (DMEM) وtransfect مع خليط من البلازميد ناقلات التكميل وكشف العدوى بنسبة 3:1 في وسائل الإعلام الخالية من المصل. بعد 24 ساعة، كشط واستعادة الخلايا في DMEM التي لا تحتوي على مصل البقر الجنيني (FBS) وإجراء ثلاث دورات تجميد ذوبان لكسر الخلايا المفتوحة وإطلاق جزيئات الفيروس. إجراء فحص البلاك مع تراكب السائل من 10٪ FBS DMEM وGGPT اختيار الكواشف حمض الميكوفينوليك (25 ميكروغرام / مل) وزانثين (250 ميكروغرام / مل) على النحو التالي: البذور لوحة 6-جيدا مع طبقة واحدة من خلايا BS-C-1. تصيب 100٪ أحاديات الخلية الملتخمة مع التخفيفات التسلسلية للخلايا المذابة بالتجميد التي تحتوي على جزيئات الفيروس لضمان الفصل الكافي بين اللويحات الفردية. تراكب مع السائل 10٪ FBS تحتوي على DMEM تحتوي على الكواشف اختيار GPT – حمض الميكوفينوليك وزانثين بتركيزات النهائي من 25 ميكروغرام / مل و 250 ميكروغرام / مل على التوالي. بعد حضانة 24 ساعة ، وإزالة تراكب السائل واستخدام المجهر الفلورسنت للبحث عن لويحات تظهر مضان أحمر منتشر المقابلة لدمج mCherry من ناقلات TDS في الفيروس. اعتمادا على الجين المستهدف والعلامة الفلورية المختارة ، يمكن أيضا ملاحظة الفلورسنت المترجم للجين الموسوم في نفس اللوحة الحمراء. اختيار لويحات متعددة لكل فيروس المؤتلف عن طريق كشط المترجمة مع طرف ماصة و 100 ميكرولتر من 5٪ FBS التي تحتوي على DMEM لنقل الخلايا إلى أنبوب Eppendorf، تليها ثلاث جولات من تجميد ذوبان الخلايا المكشطة لإطلاق الفيروسات المؤتلفة. إضافة DMEM تحتوي على تجميد ذوبان الفيروس إلى طبقة واحدة من الخلايا في لوحة 12 جيدا لتضخيم الفيروسات المؤتلفة مع الكواشف اختيار GPT في وسائل الإعلام النمو. كشط التضخيمات الناجحة 24 ساعة بعد العدوى. إجراء فحص لوحة لويحات تضخيمها بنجاح عرض مضان أحمر، وهذه المرة مع تراكب agarose واختيار GPT، على النحو التالي: البذور لوحة 6-جيدا مع طبقة واحدة من خلايا BS-C-1. تنفيذ تخفيف المسلسل من الفيروسات المؤتلفة وتصيب الآبار مع تخفيف متزايد من الفيروسات في FBS الحرة DMEM. 1 ساعة بعد العدوى، وإزالة وسائل الإعلام السائلة وتراكب كل بئر مع 0.5٪ agarose في الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية (MEM) التي تحتوي على 2.5٪ FBS، 292 ميكروغرام / مل L-الجلوتامين، 100 U/ml البنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربتوميسين، جنبا إلى جنب مع الكواشف اختيار GPT. 2-3 أيام بعد العدوى، واختيار لويحات عرض الفلورسينس التي هي على حد سواء الأحمر ولون علامة الفلورسنت المختار لتضخيم مرة أخرى، وهذه المرة مع عدم وجود اختيار GPT. إجراء المقايسة لوحة المقبل مع تراكب agarose مع عدم وجود تحديد. اختيار لويحات التي فقدت مضان أحمر منتشر ولكن الاحتفاظ بفلورنس المترجمة المقابلة لعلامة الاختيار. مواصلة تنقية البلاك مع عدم وجود اختيار للحصول على مخزون نقي من الفيروسات المؤتلفة التي فقدت الجينات اختيار mCherry وgpt ولكن الاحتفاظ مضان المترجمة المقابلة للوسم المختار. فحص المخزونات نقية عن طريق فحص البلاك ، يجب أن يكون لجميع اللوحات نمط افتراضي مماثل للبلاك. استخدام فحص PCR من الحمض النووي الجينومي لضمان المخزونات الفيروسية نقية. تصميم التمهيديات التي تحيط موقع إدراج الجينات الفلورية والمبرمجين التي تضخيم الجين الفلورسنت إدراج نفسها. مجموعات مختلفة من هذه التمهيديات سوف تنتج amplicons PCR من شأنها أن تكشف عن إدراج الجينات وتشير إلى النقاء. تضخيم المخزونات الفيروسية ليتم فحص PCR في بئر واحد من طبقة أحادية من 12 جيدا من خلايا BS-C-1. 24 ساعة بعد العدوى، كشط الخلايا المصابة في 250 ميكروغرام من DMEM. خلايا الطرد المركزي المصابة (18000 × غرام لمدة 10 دقائق و 4 درجات مئوية) ، وإزالة الكريات الخلية الفائقة وإعادة الإنفاق في 500 ميكرولتر TE (10 mM Tris-HCl و 1 mM EDTA ، pH 8) مع 0.1٪ (v /v) SDS. دوامة إلى خلايا الليس. إضافة 500 ميكرولتر فينول-الكلوروفورم-إيزاميل أكوهول، عكس لخلط. جهاز الطرد المركزي (18000 × غرام لمدة 4 دقائق و 4 درجات مئوية). خذ الناسخ وكرر. تنفيذ هطول الأمطار الإيثانول على supernatant بإضافة 1 مل 100٪ الإيثانول (المبردة) و خلات الصوديوم 50 ميكرولتر، عكس لخلط. اترك عند -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو -80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أجهزة الطرد المركزي (18000 x ز لمدة 30 دقيقة، 4 درجة مئوية)، وإزالة جميع السائل والسماح الحمض النووي عجلت للهواء الجاف. ريسوسبند في 50 ميكرولتر TE. استخدم هذا كقالب لفحص الحمض النووي الجينومي PCR. 3. جيل من الفيروسات المؤتلفة تحمل أكثر من علامة واحدة Coinfect نفس الخلية monolayer مع الفيروسات المؤتلفة الفلورسنت لإنشاء مزدوجة أو ثلاثية وصفت الفيروسات أو تكرار الإجراء من البروتوكول 1) مع علامة مختلفة. تنقية الفيروسات على أساس البلاك النمط الظاهري أو فحص PCR من الحمض النووي الجينومي عزل الفيروس.

Representative Results

يسرد الشكل 1 البنى المختلفة المطلوبة لهذا الإجراء، والتي يتم تصنيعها إما(الشكلان 1ب و1c)أو التي تم إنشاؤها بواسطة خطوات الاستنساخ(الشكل 1D). ويقدم الشكل 2 مخططا للإجراء التجريبي مع صور لوحة فلورية تمثيلية ل VACV المؤتلف A3-GFP المصور لكل خطوة من خطوات عملية الاختيار. في الشكل 3, فيروسات vaccinia المؤتلفة التعبير عن البروتينات الموسومة علامات الفلورسنت التي تستهدف البروتينات الهيكلية الفيروسية A3 و F13, التي هي جزء من جوهر الفيروس الداخلي23 والمغلف الخارجي24, على التوالي, وتظهر. يتم تصوير ملاحظات لويحات الفيروسية والخلايا المصابة لكل من الفيروسات المؤتلفة التي تم إنشاؤها. تم اختبار كفاءة إعادة التركيب المتجانسة للناقلات مع جينوم VACV ، الذي يحتوي على مناطق منخفضة يصل إلى 70 نقطة أساس من الأوهام إليها ، ويتم تصوير النتائج في الشكل 4. كان النجاح النسبي لتحديد لويحات الفيروسية المصنوعة من إعادة التركيب مع ناقلات تحتوي على 100 bp homology هو المنطق وراء اختيار توليف 150 bp طول الذراعين الأيسر والأيمن من الأوهام إلى الجين المستهدف. الشكل 1 – الأرقام 1- الأرقام 1 ناقل إعادة التركيب التحديد المهيمن العابر (TDS). (أ) TDS المتجه مع علامات اختيار gpt و mCherry. (ب)تم تصميم الذراعين الأيسر والأيمن من homology مع مواقع تقييد محددة في ما بين ويحيط بأذرع التماثل. وكانت مواقع التقييد بين الذراعين الأيسر والأيماني المستخدمة في هذه الطريقة هي NotI و BamHI ، كما يستخدم موقع NotI كرابط بين الجين وعلامة الفلورسنت. (ج) علامات الفلورسنت المتوافقة مع هذه الطريقة محاطة بمواقع تقييد مناظرة. بعض العلامات المستخدمة هي GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر) ، RFP (بروتين الفلورسنت الأحمر) ، Cerulean (تحسن على ECFP ، بروتين فلوري سماوي ، من خلال تكوين25موجه من الموقع) وميني سوغ ، وهو بروتين فلوري تم تصميمه من GFP مما يخلق منتجا قابلا للحل من قبل EM على الإضاءة26. (د)خطوات الاستنساخ التي ينطوي عليها توليد ناقل إعادة تركيب TDS النهائي. أول من تم تصنيعه oligonucleotide التي تحتوي على الذراعين الجناحين الأيسر والأيمان هو استنساخ الأولى في ناقلات TDS. وهذا يوفر ناقل إعادة التركيب الذي يمكن نقل أي علامة من الاختيار داخل وخارج عن طريق الاستنساخ في مواقع تقييد أدرجت بين الذراعين الأيسر والأيمين. انقر هنا لعرض صورة أكبر. الشكل 2 – الأرقام 2- الأرقام التي تم مخطط تفصيلي للإجراء التجريبي لإنشاء فيروس vaccinia المؤتلف. يتم تصوير الأحداث التي تحدث على المستويين الوراثي والخلوي ، جنبا إلى جنب مع صور لوحة تمثيلية تحدد الخطوات التالية لإنشاء فيروس vaccinia الفلوري المسمى A3-GFP. (أ)يتم تحويل الخلايا المصابة بفيروس vaccinia مع ناقلات إعادة التركيب TDS. (ب)في هذا الشكل، يتم تصوير فقط نتيجة إعادة التركيب الأيسر ويستخدم المثال GFP كعلامة الفلورسنت المفضلة. ومن شأن إعادة التركيب باليد اليمنى أن تؤدي إلى دمج البلازميد TDS بأكمله في الجينوم بطريقة مماثلة، باستثناء أن العلامة ستدمج في الجين المستهدف بأكمله في الخطوة المتوسطة، أي الخطوة جيم. يتم إجراء فحص البلاك على أحادي الطبقة الخلية مع مزيج إعادة التركيب ويخضع لاختيار GPT. (ج)يتم اختيار وتضخيم لويحات تعرض كل من الفلورسينس الأحمر والأخضر ، المقابلة لتعبير mCherry و GFP على التوالي. بمجرد إزالة الاختيار ، سيكون هناك فقدان الفلورسينس الأحمر المقابل لفقدان جينات gpt و mCherry (D) ويتم اختيار اللوحات التي تعرض الفلورسينس الأخضر حصريا وتضخيمها(E). انقر هنا لعرض صورة أكبر. الشكل 3 – الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن النتائج التمثيلية لنظام إعادة دمج TDS. صور تصور لويحات كاملة من VACV المؤتلفة تصيب الخلايا بعد 48 ساعة(أ، ج، ه؛ شريط مقياس 100 ميكرومتر) ، مصحوبة بصورة لخلية واحدة مصابة بالفيروس المؤتلف المقابل بعد 8 ساعات(ب، د، و؛ شريط مقياس 10 ميكرومتر). تم اختيار الجينات المقابلة للبروتينات المترجمة virion لتصور جزيئات الفيروس. A3 هو البروتين الأساسية للvirion vaccinia (أ، ب) و F13 (ج، د) هو بروتين مغلف الفيروسية. يظهر أيضا فيروس مزدوج الموسومة مع كل من fluorescently المسمى A3 و F13 (ه، و) . انقر هنا لعرض صورة أكبر. الشكل 4 – الأرقام 4- الأرقام التي تم ال التحليل الكمي لكفاءة إعادة التركيب بين ناقلات المؤتلف والجينوم VACV. أصيبت الطبقات الأحادية BS-C-1 ب VACV وجرى إصابة 1 ساعة بعد العدوى بثلاث ناقلات إعادة دمج تحتوي على مناطق من الأوهام إما 500 نقطة أساس أو 100 نقطة أساس أو 70 bp إلى جينوم VACV. كما احتوى كل متجه على كاسيت TDS الذي يتألف من جينات اختيار gpt و mCherry. تم استرداد الخلايا 24 ساعة بعد العدوى وlysed للافراج عن الفيروسات المؤتلفة التي تشكلت. تم إجراء فحوصات البلاك على lysates الخلية مع وسائل الإعلام اختيار GPT ولوحات تظهر مشيري مضان تم عدها كمتلفات ناجحة. انقر هنا لعرض صورة أكبر. الشكل 5 – الأرقام 5- الأرقام التي تم خريطة لمتجه GPT-mCherry TDS الذي يعرض موقع الاستنساخ المتعدد. وقد وصف المتجه سابقا22 وتم إنشاء خريطة متجه بمساعدة خريطة EZ Plasmid v1.9 من مجموعة مختبر تشانغ (SCU). انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Discussion

تصف هذه التقنية بروتوكولا فعالا ووحدات لإنشاء فيروسات مؤتلفة تعبر عن البروتينات الفيروسية الموسومة بالفلورسنت. تضمن الطريقة أن التغيير الوحيد في الجينوم الفيروسي هو إضافة علامة أو علامة ، دون ترك علامات اختيار. طول الذراع القصير المطلوب لإعادة التركيب المتجانسة تمكن من توليفها المباشر ، والقضاء على عدة جولات تستغرق وقتا طويلا من PCR والاستنساخ ، في حين يتم استخدام مضان mCherry واختيار GPT الأيضية لعزل وسيطة إعادة التركيب الفيروسي. يمكن حل هذه الوسيطات، بعد إزالة التحديد، إلى فيروس مع جين الموسومة أو العودة إلى نوع الوالدين. وقد وصفت طريقة مماثلة تنطوي على استخدام كل من الفلورسنت واختيار الأيض سابقا27 على الرغم من أن الطريقة المستخدمة في هذه الدراسة يستخدم أقصر, توليفها مناطق التماثل, السماح بتحديد الفيروس المؤتلف المطلوب عن طريق تصوير مضان الجين الموسومة من الفائدة. ينطبق هذا الاختيار الثانوي فقط على وضع علامات على الجينات الفيروسية المعبر عنها للغاية والتي تنتج مضانا كافيا في فحص البلاك. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن يتصور إدراج كاسيت التعبير الكامل، على سبيل المثال بروتين الفلورسنت تحت مروج الفيروسية قوية. في هذه الحالة فإن الذراعين الأيسر والأييم تحديد نقطة الإدراج بدلا من الجين الفيروسي ليتم وضع علامات عليها.

هناك بعض الخطوات الرئيسية التي أثبتت فائدتها أثناء الإجراء التجريبي. أثبت التراكب السائل في الخطوة 2.3.3 الموصوفة أعلاه أنه حاسم للكشف عن لويحات الفلورسنت الحمراء /الخضراء وعزلها. ونحن نعتقد أن الجمع بين الكواشف اختيار GPT وتراكب agarose ردع نمو الفيروسات المؤتلفة، وبالتالي تحولت إلى تراكب السائل للخطوة الأولى من تضخيم الفيروسات بعد العدوى. من المهم أيضا اختيار لويحات فلورية تظهر مضان لون العلامة المترجمة للتخصيب والتنقية ، حيث قد تؤدي الوسيطات الناتجة عن إعادة دمج الذراع الأيسر إلى تفلور منتشر لوحظ في لويحات إذا كان الذراع الأيسر يحتوي أيضا على تسلسل المروج. يمكن أيضا استبدال جين علامة mCherry في ناقل TDS ب gfp، على سبيل المثال ، للسماح بدمج واختيار mCherry بسهولة كعلامة فلورية.

تختلف بعض التقنيات المذكورة أعلاه قليلا عن الطرق الراسخة لإنشاء فيروس vaccinia المؤتلف. على سبيل المثال، وزارة الداخلية من الفيروسات المستخدمة في إنشاء المؤتلفات عادة أقل من 128،ولكن استخدام أعلى MOIs كان كافيا لإنشاء فيروس vaccinia المؤتلف بهذه الطريقة. استخدام الكواشف اختيار GPT يتطلب عادة التنبيب المسبق للخلايا مع الكواشف الاختيار18، ولكن إضافتها خلال مرحلة الإنقاذ بعد العدوى لا تزال توفر مجموعة كافية من المفاتنين المطلوبين ، لا سيما بسبب وجود علامة اختيار الفلورسنت كذلك.

كما ذكر سابقا، واحدة من القيود المفروضة على هذه التقنية هو أن خطوة اختيار مضان الثانوية يعتمد على البروتين الموسومة من الفائدة التي أعرب عنها للغاية، على المستوى الذي يمكن الكشف عنها عن طريق العين في فحص البلاك. وبدون ذلك، سيكون من الممكن تنقية الفيروسات التي أظهرت فقط مشرى مضان، منها ما لا يقل عن 50٪ تحتوي على الفيروسات المؤتلفة المطلوبة، والتي يمكن تحديدها من خلال الاستراتيجيات الجزيئية مثل PCR الموصوفة في الخطوة 2.12 أعلاه. وثمة قيد آخر يمكن أن يكون تعطيل بعض البروتينات نتيجة لوضع علامات عليها. قد تخضع علامة الفلورسنت لطفرات أو يتم استئصالها من قبل الفيروس المؤتلف مع التمرير بمرور الوقت. ولذلك، يوصى بأخذ عينات منتظمة من مخزونات الفيروسات المؤتلفة عن طريق المجهر وال PCR. وأخيرا، قد يكون هناك حد لعدد البروتينات الموسومة بالفلورسنت التي يمكن دمجها في فيروس واحد. أحد جوانب هذا هو القدرة على تصور كل منهم في وقت واحد; ونظرا للطبيعة المتداخلة لأطياف الانبعاثات من العلامات الفلورية المتاحة، من المهم اختيارها بعناية لضمان الحد الأدنى من النزيف الطيفي من خلال. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام علامات وثيقة الصلة مثل GFP و Cerulean يفتح إمكانية إعادة التركيب بين الاثنين ، اعتمادا على مواقعهما في الجينوم المؤتلف.

الطبيعة المعيارية لهذه التقنية تمكن من استبدال بسيط من العلامات الفلورية على أساس التوافق مع غيرها من تلطيخ و / أو علامات الخيارات. عن طريق استئصال علامات قابلة للاختيار، وطريقة TDS يسمح لإضافة المسلسل من البروتينات الفلورية المختلفة أو مزيج من العلامات القائمة على TDS مع حذف الجينات المستندة إلى TDS للتحليلات phenotypic29. وكمثال على فائدة هذا النهج، تم توليد فيروس فلوري مزدوج الموسومة التي تسمي نواة الفيروس وغشاء WV. ويمكن استخدام دراسات التصوير مع هذا الفيروس لدراسة الحركة، مورفوجينيسيس والتفاف الفيروس أثناء تكرار الفيروس. حتى الآن غير المكترة vaccinia البروتينات الفيروسية قد تكون أيضا الموسومة ودرس من قبل هذه التقنية.

وقد استخدم فيروس Vaccinia على نطاق واسع في دراسات التصوير بسبب العديد من خصائص الفيروس التي هي مواتية للفحص المجهري للخلايا الحية. يتم التعبير عن العلامات الفلورية من الجينوم الفيروسي ، مما يلغي الحاجة إلى العدوى ، مما يتيح تحليل الخلايا الأولية المشتقة من الحيوانات المصابة أو الخلايا غير القابلة للإصابة بسهولة. في البداية، استخدمت VACVs الفلورسنت لتتبع دون الخلوية بسيطة من حركة الفيروس30،ولكن النهج الأكثر حداثة وسعت فائدتها لتشمل دراسات FRET31،FRAP في جزيئات فيروس واحد32،المروجين المراسلين33،داخل الجسم التصوير34،والدراسات الهيكلية35-37. كل هذه التقنيات يمكن أن تكون في متناول اليد أسهل وأقرب إلى جانب هذه الطريقة لخلق الفيروسات الفلورية المؤتلفة.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأسترالي منحة مشروع اكتشاف الاتحاد #1096623.

Materials

Mycophenolic acid Sigma-Aldrich M3536-50MG Dissolve in 0.1N NaOH
Xanthine Sigma-Aldrich X0626-5G Dissolve in 0.1N NaoH
FuGENE HD transfection reagent Promega E2311
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 Olympus, Chroma BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Fenner, F. Adventures with poxviruses of vertebrates. FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).
  2. Goebel, S. J., et al. The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus. Virology. 179, 247-266 (1990).
  3. Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat. J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).
  4. Roberts, K. L., Smith, G. L. Vaccinia virus morphogenesis and dissemination. Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).
  5. Gammon, D. B., Evans, D. H. The 3 ‘-to-5 ‘ Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination. J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).
  6. Yao, X. D., Evans, D. H. Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination. J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).
  7. Ward, B., Isaacs, S. N. . Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. 16, 205-218 (2004).
  8. Smith, G. L., Moss, B. Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000. Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).
  9. Heuser, J. Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic "honeycomb" surface coat. J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).
  10. Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. Poxvirus host cell entry. Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).
  11. Ward, B. M. Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions. J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).
  12. Carter, G. C., et al. Vaccinia virus cores are transported on microtubules. J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).
  13. Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).
  14. Rodriguez, J. F., Esteban, M. Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants. J. Virol. 63, 997-1001 (1989).
  15. Blasco, R., Moss, B. Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation. Gene. 158, 157-162 (1995).
  16. Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus – a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).
  17. Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression. Gene. 47, 193-199 (1986).
  18. Falkner, F. G., Moss, B. Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors. J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).
  19. Liu, G. Q., et al. Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker. Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).
  20. Domínguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).
  21. Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).
  22. Cordeiro, J. V., et al. F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection. Plos One. 4, (2009).
  23. Jensen, O. N., et al. Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis. J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).
  24. Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen. J. Virol. 58, 757-764 (1986).
  25. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for. 22, 445-449 (2004).
  26. Shu, X. K., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. Plos Biol. 9, (2011).
  27. Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection. J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).
  28. Broder, C. C., Earl, P. L. . 62, 173-197 (1997).
  29. Blasco, R., Moss, B. Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein. J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).
  30. Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J., Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus. Viral Transport, Assembly and Egress. , 155-177 (2011).
  31. Jeshtadi, A., et al. Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).
  32. Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility. Nature. 458, (2009).
  33. Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).
  34. Dénes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors. Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).
  35. Humphries, A. C., et al. Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread. Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).
  36. Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy. J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).
  37. Horsington, J., et al. A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus. PLoS Pathog. 9, (2013).

Tags

Fluorescent Protein TaggingVaccinia VirusRecombinant Virus GenerationHomologous RecombinationTransient Dominant SelectionMetabolic SelectionLive-cell MicroscopyVirus-host Interactions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Marzook, N. B., Procter, D. J., Lynn, H., Yamamoto, Y., Horsington, J., Newsome, T. P. Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins. J. Vis. Exp. (83), e51151, doi:10.3791/51151 (2014).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image