蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

1. 再結合ベクトルの作成 N-またはC末端に対象のウイルス遺伝子を標識するために必要な相同性の150bpの長い横置き領域(左右の腕と呼ばれる)を特定する( 図1b参照)。 選択した一対の制限部位によって分離された150bp左右の腕を含むオリゴヌクレオチド配列を設計する。この全体のシーケンスは、合成された後にTDSベクターに組み込むことを可能にするために、(最初のペアとは異なる)第2の制限部位のペアによって横たわらなければならない。配列が所望の挿入部位とフレーム内にあるという制限部位を有するオリゴヌクレオチドを設計する際には注意してください。 合成用オリゴヌクレオチドを設計する際には、左右の腕の間に制限部位を組み込み、選択した蛍光タグの開いた読み取りフレームに隣接するものと一致する必要がある( 図1b参照)。NotI制限部位を、左腕と蛍光タグの開始との間の3つのアミノ酸リンカーとして使用することができる。 PCRによって蛍光タグの両側にこれら同じ制限部位を組み込む( 図1cを参照)。 合成したフラグメントを TDS ベクターに複製します。 ホモロジーの左右の腕領域の間の制限部位を使用して、得られた再結合ベクターに蛍光タグをクローン化する( 図1dを参照)。 2. 組換えウイルス生成 図2に従って、多重感染性(MOI)>1で、血清フリー培地中のバクシニアウイルスを有するBS-C-1細胞の単層に感染する。 1時間の感染後、Dulbeccoの修飾イーグル培地(DMEM)を有するレスキュー細胞と、無血清培地中の3:1の比での組換えベクタープラスミドおよびトランスフェクション試薬の混合物を用いたトランスフェクト。 24時間後、牛胎児血清(FBS)を含んでいないDMEMの細胞を掻き取り、回収し、開いた細胞を破壊してウイルス粒子を放出するために3回の凍結融解サイクルを行う。 10% FBS DMEMおよびGPT選択試薬ミコフェノール酸(25 μg/ml)とキサンチン(250 μg/ml)の液体オーバーレイで、次のようにプラークアッセイを実行します。 6ウェルプレートにBS-C-1細胞の単層をシードします。 ウイルス粒子を含む凍結解凍細胞の連続希釈液を100%コンフルエント細胞単層に感染させることで、個々のプラークの適切な分離を確実にする。 GPT選択試薬を含むDMEMを含む液体10Sとのオーバーレイ – ミコフェノール酸とキサンチンは、それぞれ25 μg/mlと250 μg/mlの最終濃度で。 24時間のインキュベーションの後、液体のオーバーレイを取り除き、蛍光顕微鏡を使用して、TDSベクターからウイルスへのmCherryの組み込みに対応する拡散赤色蛍光を示すプラークを探します。標的遺伝子および選択した蛍光タグに応じて、タグ付き遺伝子の局在した蛍光も同じ赤色プラークで観察され得る。 各組換えウイルスに対して、ピペットチップを使用した局所的な擦り傷と、DMEMを含む5Sの100 μlの100 μlを選んで細胞をエッペンドルフチューブに移し、続いて3ラウンドの掻き取り細胞を凍結解凍して組換えウイルスを放出する。 凍結解凍ウイルスを含むDMEMを12ウェルプレートの細胞の単層に加え、増殖培地中のGPT選択試薬で組換えウイルスを増幅する。感染後24時間の増幅に成功した。 赤い蛍光を示すプラークの正常に増幅されたプラークのプラークアッセイを実行し、今度はアガロースオーバーレイとGPT選択を行い、次のように行います。 6ウェルプレートにBS-C-1細胞の単層をシードします。 組換えウイルスの連続希釈を行い、FBSフリーDMEMで増加するウイルスの希釈にウェルに感染します。 感染後1時間、液体培地を取り除き、2.5S、292 μg/ml L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含む最小必須培地(MEM)で0.5%アガロースを重ねたGPT選択試薬を重ねた。 感染後2〜3日、選択した蛍光タグの赤色と色の両方が再び増幅される蛍光を示すプラークをピックし、今回はGPT選択なし。 選択なしのアガロースオーバーレイで次のプラークアッセイを実行します。 拡散赤蛍光を失ったが、選択したタグに対応する局所的な蛍光を保持しているプラークを選んでください。 選択なしでプラークの精製を続けると 、mCherry および gpt 選択遺伝子を失ったが、選択されたタグに対応する局所的な蛍光を保持する組換えウイルスの純粋なストックを得る。チェック株はプラークアッセイによって純粋であり、すべてのプラークは同様のプラーク表現型を有するべきである。 ゲノムDNAのPCRスクリーニングを使用して、ウイルスストックが純粋であることを確認します。 蛍光遺伝子挿入部位に隣接するプライマーと、挿入された蛍光遺伝子自体を増幅するプライマーを設計する。これらのプライマーの異なる組み合わせは、遺伝子挿入を検出し、純度を示すPCRアンプリコンを生成します。 ウイルス株を増幅して、PCRを1つのウェルでスクリーニングし、BS-C-1細胞の12ウェルプレート単層をスクリーニングする。 感染後24時間、感染した細胞をDMEMの250 μlに擦り込む。 遠心分離機感染細胞(18,000 x g 10分間、4°C)、上清を除去し、500 μl TE(10 mM Tris-HClおよび1 mM EDTA、pH 8)で細胞ペレットを0.1%(v/v)SDSで再懸濁します。細胞をライスするボルテックス。 500 μl フェノール-クロロホルム-イソアミルアコホールを加え、インバートを混ぜます。遠心分離機(18,000 x g 4分、4°C)。上清を取り、繰り返します。 1ml100%エタノール(チルド)と50μl酢酸ナトリウムを加えて上清にエタノール沈殿を行い、インバートを混合する。 -20 °Cで一晩、または-80°Cで1時間放置します。遠心分離機(30分間18,000 x g、4°C)、すべての液体を取り除き、沈殿したDNAを空気乾燥させます。50 μl TE で再中断します。 これをゲノムDNA PCRスクリーニングのテンプレートとして使用します。 3. 複数のタグを持つ組換えウイルスの生成 同じ細胞単層を蛍光組換えウイルスと共感染させて、ダブルまたはトリプル標識ウイルスを作成するか、プロトコル1)から繰り返し手順を別のタグで作成します。 プラーク表現型またはPCRスクリーニングに基づいてウイルスを精製するウイルス分離ゲノムDNA。