Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

N. Bishara Marzook; Dean J. Procter; Helena Lynn; Yui Yamamoto; Jacquelyn Horsington; Timothy P. Newsome

doi:10.3791/51151

JoVE Journal > Immunology and Infection

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Immunologie und Infektion

Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

Published: January 17, 2014

doi:

10.3791/51151

N. Bishara Marzook*¹, Dean J. Procter*¹, Helena Lynn¹, Yui Yamamoto², Jacquelyn Horsington³, Timothy P. Newsome¹

¹School of Molecular Bioscience,University of Sydney, ²Department of Medicine,Center for Vascular Research, ³Asia Pacific Centre for Animal Health, Faculty of Veterinary Science,University of Melbourne

Summary

Hier wird ein schnelles und modulares Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Impfstoffviren beschrieben, die fluoreszierend markierte Proteine gleichzeitig mit der Methode der transienten dominanten Selektion exezieren.

Abstract

Die Kennzeichnung viraler Proteine mit fluoreszierenden Proteinen hat sich als unverzichtbarer Ansatz erwiesen, um unser Verständnis von Virus-Host-Wechselwirkungen zu fördern. Das Vaccinia-Virus (VACV), der Lebendimpfstoff, der bei der Ausrottung von Pocken eingesetzt wird, ist aufgrund seiner großen Virionsgröße und der Leichtigkeit, mit der er auf Genomebene entwickelt werden kann, besonders für die fluoreszierende Lebendzellmikroskopie geeignet. Wir berichten hier über ein optimiertes Protokoll zur Generierung rekombinanter Viren. Es wurden die minimalen Anforderungen an eine gezielte homologe Rekombination während der Vaccinia-Replikation ermittelt, was eine Vereinfachung der Konstrukterzeugung ermöglicht. Dies ermöglichte die Allianz der transienten dominanten Selektion (TDS) mit einem fluoreszierenden Reporter und einer metabolischen Selektion, um einen schnellen und modularen Ansatz zur fluoreszierenden Kennzeichnung viraler Proteine zu bieten. Durch die Rationalisierung der Erzeugung fluoreszierender rekombinanter Viren sind wir in der Lage, nachgelagerte Anwendungen wie die erweiterte bildgebende Analyse vieler Aspekte des Virus-Host-Zusammenspiels, die während der Virusreplikation auftreten, zu erleichtern.

Introduction

Das Vaccinia-Virus (VACV) ist das prototypische Poxvirus und steht in entham mit dem Variolavirus, dem Erreger der Pocken, in Verbindung. Beide Viren sind Mitglieder der Gattung orthopox, die andere bemerkenswerte Krankheitserreger wie Affenpocken und Ektomienvirus (Mauspocken)¹umfasst. Orthopoxviren haben große doppelsträngige DNA-Genome (180-220 kb), die mehr als 200 vorhergesagte offene Leserahmen^2,3kodieren. Die Replikation dieser Viren beinhaltet die Bildung einer perinuclearvirus-Fabrik, in der ausgereifte Viren (MV) hergestellt werden, und das Trans-Golgi-Netzwerk, in dem eine Teilmenge von MV zwei zusätzliche Membranen anschafft, um verpackte Viren (WV) zu erzeugen (überprüft von Roberts und Smith⁴). Orthopox-Genome sind aufgrund des hohen Grades an genetischer Rekombination, der ein Merkmal der VACV-Genomreplikation ist und durch die virale DNA-Polymerase⁵vermittelt wird, sehr gut für genetische Manipulationen geeignet. Die Generierung rekombinanter Viren beruht auf homologen Rekombinationen und linearen DNA-Molekülen, wobei Homologien von nur 12 bp ausreichen, um eine Rekombination in impfvirusinfizierten Zellen zu vermitteln⁶. Die fluoreszierende Kennzeichnung von Impfstoffviren kann aufgrund der großen Größe von Orthopoxpartikeln extrem helle Viruspartikel hervorigen, was die Aufnahme vieler fluoreszierender Proteine pro Virion⁷ermöglicht. Vaccinia hat die Fähigkeit, große Fragmente fremder DNA⁸ zu tragen, und darüber hinaus kann das Fehlen einer starren Kapsidsymmetrie ein gewisses Maß an Flexibilität beim Ausdruck viraler Proteingenfusionen aus ihrem endogene loci⁹ermöglichen. Fluoreszierende Kennzeichnung von VACV-Proteinen hat sich als unschätzbar erwiesen für die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen auf subzellulärer Ebene, insbesondere im Bereich des Viruseintrags¹⁰, Transport^11-13und Morphogenese, insbesondere von verpackten Virionen⁷.

Rekombinante Viren können durch Rettung eines abgeschwächten Wachstumsphäpnotyps^14,15, metabolische Selektion^16-18oder durch Expression eines Markergens(z.B. X-gal¹⁹ oder fluoreszierendes Protein^13,20) ausgewählt werden. Hier beschreiben wir die Auswahl fluoreszierender Viren mit einer leistungsstarken Kombination aus fluoreszierender und metabolischer Selektion. Transient dominante Selektionsvektoren (TDS), entwickelt von Faulkner und Moss (1990)²¹, ermöglichen die Integration von Markern zusammen mit dem gewünschten fluoreszierend gekennzeichneten Gen von Interesse. Wenn die metabolische Selektion entfernt wird, kann ein sekundäres Rekombinationsereignis auftreten, das die Selektionsgene ausklammert, aber das fluoreszierend markierte Virusprotein intakt lässt. Abbildung 2 gibt einen Überblick über das experimentelle Verfahren. Die in dieser Studie verwendeten Selektionsgene sind mCherry und das Escherichia coli guanine phosphoribosyltransferase (gpt) Gen, beide aus einem synthetischen frühen/späten viralen Promotor exprimiert und zuvor von Cordeiro et al. verwendet. ²² Darüber hinaus gibt es fluoreszenz des markierten Fusionsproteins von Interesse. Wenn die metabolische Auswahl entfernt wird, werden die wählbaren Marker (mCherry und gpt) ausgeschnitten, sodass nur die Fluoreszenz des markierten Gens übrig bleibt, was die Identifizierung der richtigen rekombinanten Viren ermöglicht. Die Exzision der Selektionsmarker bietet die Möglichkeit, mehrere fluoreszierende Tags zu kombinieren, so dass wir Viren mit der Fähigkeit erzeugen können, mehrere virale Proteine gleichzeitig fluoreszierend zu kennzeichnen. Frühere Studien haben die minimalen Homologieanforderungen für die Vaknien-Rekombination von linearen und kreisförmigen DNA-Molekülen bestimmt, die in mit Dematratien infizierte Zellen transfiziert wurden⁶. Wir wollten die Rekombinationseffizienzen unterschiedlicher Homologielängen flankierender Arme im gpt-mCherry TDS-Vektor durch seine Aufnahme in das vaccinia virale Genom bestimmen. Es wurde festgestellt, dass homologe Regionen von 100 bp im TDS-Vektor ausreichen, um die Einfügung rekombinanter DNA in das VACV-Genom durch homologe Rekombination zu zielen und zu vermitteln (Abbildung 4). Während kleinere Homologielängen auch eine Rekombination ermöglichen würden, boten 100 bp Homologielängen genügend rekombinante Viren, die leicht mit metabolischer und fluoreszierender Selektion identifiziert werden konnten. DNA-Fragmente dieser Größe können zu relativ niedrigen Kosten kommerziell synthetisiert werden und erleichtern die Produktion mehrerer Vektoren für die Bildung rekombinanter Viren erheblich. Wir haben uns entschieden, die Homologielänge auf 150 bp zu erhöhen, um eine höhere Rekombinationshäufigkeit zu bieten und gleichzeitig die Kosten für die Synthese der Oligonukleotidsequenz flankierender Regionen niedrig zu halten.

Protocol

1. Erstellen des Rekombinationsvektors Identifizieren Sie 150 bp lange flankierende Bereiche der Homologie (als linke und rechte Arme bezeichnet), die erforderlich sind, um entweder N- oder C-terminal zu kennzeichnen, das virusische Gen von Interesse zu kennzeichnen (siehe Abbildung 1b). Entwerfen Sie eine Oligonukleotid-Sequenz, die die 150 bp linken und rechten Arme umfasst, die durch ein Paar von Restriktionsstellen ihrer Wahl getrennt sind. Diese gesamte Sequenz muss auch durch ein zweites Paar von Restriktionsstellen (anders als das erste Paar) flankiert werden, um die Aufnahme in den TDS-Vektor nach der Synthese zu ermöglichen. Achten Sie beim Entwerfen des Oligonukleotids mit Restriktionsstellen darauf, dass die Sequenzen im Rahmen mit der gewünschten Einfügestelle sind. Integrieren Sie Bei der Gestaltung des Oligonukleotids für die Synthese Restriktionsstellen zwischen dem linken und dem rechten Arm,die denen entsprechen müssen, die den offenen Leserahmen des fluoreszierenden Tags der Wahl flankieren (siehe Abbildung 1b). Es ist möglich, eine NotI-Einschränkungsstelle als drei Aminosäure-Linker zwischen dem linken Arm und dem Beginn des Fluoreszenz-Tags zu verwenden. Integrieren Sie dieselben Restriktionssites auf beiden Seiten des Fluoreszenz-Tags durch PCR (siehe Abbildung 1c). Klonen Sie das synthetisierte Fragment in den TDS-Vektor. Klonen Sie das fluoreszierende Tag in den resultierenden Rekombinationsvektor mithilfe der Einschränkungsstellen zwischen dem linken und rechten Armder der Homologie (siehe Abbildung 1d). 2. Rekombinante Virusgenerierung Gemäß Abbildung 2infizieren Sie eine Monoschicht von BS-C-1-Zellen mit dem Impfvirus in serumfreien Medien bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) > 1. 1 Std. nach der Infektion, Rettungszellen mit Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM) und transfekt mit einer Mischung aus Rekombinationsvektorplasmid und Transfektionsreagenz im Verhältnis 3:1 in serumfreien Medien. Nach 24 Stunden, kratzen und erholen Zellen in DMEM enthält kein fetales Rinderserum (FBS) und führen Drei Frost-Tau-Zyklen, um aufgebrochene Zellen zu brechen und Viruspartikel freizusetzen. Führen Sie einen Plaque-Assay mit einem flüssigen Overlay von 10% FBS DMEM und GPT-Auswahlreagenzien Mycophenolsäure (25 g/ml) und Xanthin (250 g/ml) wie folgt durch: Säen Sie eine 6-Well-Platte mit einer Monoschicht von BS-C-1-Zellen. Infizieren Sie 100% konfluente Zellmonolayer mit seriellen Verdünnungen der gefriergetauten Zellen, die Viruspartikel enthalten, um eine angemessene Trennung einzelner Plaques zu gewährleisten. Overlay mit flüssigen 10% FBS enthaltende DMEM enthält die GPT-Auswahlreagenzien – Mycophenolsäure und Xanthin bei Endkonzentrationen von 25 g/ml bzw. 250 g/ml. Nach einer 24-stündigen Inkubation entfernen Sie die Flüssigkeitsüberlagerung und suchen mit einem Fluoreszenzmikroskop nach Plaques, die eine diffuse rote Fluoreszenz aufweisen, die der Einbeziehung von mCherry aus dem TDS-Vektor in das Virus entspricht. Je nach Zielgen und gewähltem Fluoreszenz-Tag kann die lokalisierte Fluoreszenz des markierten Gens auch in derselben roten Plaque beobachtet werden. Wählen Sie mehrere Plaques für jedes rekombinante Virus durch lokalisiertes Abkratzen mit einer Pipettenspitze und 100 l 5% FBS, das DMEM enthält, um Zellen in ein Eppendorf-Rohr zu übertragen, gefolgt von drei Runden Gefriertau von abgekratzten Zellen, um rekombinante Viren freizusetzen. Fügen Sie das DMEM enthaltende gefriertaute Virus zu einer Monoschicht von Zellen in einer 12-Well-Platte hinzu, um rekombinante Viren mit GPT-Selektionsreagenzien in den Wachstumsmedien zu verstärken. Kratze erfolgreiche Verstärkungen 24 Stunden nach der Infektion. Führen Sie einen Plaque-Test von erfolgreich verstärkten Plaques mit roter Fluoreszenz durch, diesmal mit einer Agarose-Overlay- und GPT-Auswahl, wie folgt: Säen Sie eine 6-Well-Platte mit einer Monoschicht von BS-C-1-Zellen. Führen Sie eine serielle Verdünnung der rekombinanten Viren durch und infizieren Sie Brunnen mit einer zunehmenden Verdünnung von Viren in FBS-freiem DMEM. 1 Std. nach der Infektion, entfernen Sie die flüssigen Medien und überlagern Sie jeden Brunnen mit 0,5% Agarose in minimalem essentiellen Medium (MEM) mit 2,5% FBS, 292 g/ml L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin, zusammen mit den GPT-Auswahlreagenzien. 2-3 Tage nach der Infektion, Wählen Sie Plaques mit Fluoreszenz, die sowohl rot ist und die Farbe der gewählten Fluoreszenz-Tag wieder zu verstärken, diesmal ohne GPT-Auswahl. Führen Sie den nächsten Plaque-Assay mit einem Agarose-Overlay ohne Auswahl durch. Wählen Sie Plaques, die ihre diffuse rote Fluoreszenz verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz beibehalten, die dem Tag der Wahl entspricht. Setzen Sie die Plaquereinigung ohne Auswahl fort, um einen reinen Vorrat an rekombinanten Viren zu erhalten, die die mCherry- und gpt-Selektionsgene verloren haben, aber die lokalisierte Fluoreszenz beibehalten, die dem gewählten Tag entspricht. Check Stocks sind rein durch Plaque Assay, alle Plaques sollten einen ähnlichen Plaque-Phänotyp haben. Verwenden Sie das PCR-Screening genomischer DNA, um sicherzustellen, dass virale Bestände rein sind. Designprimer, die die fluoreszierende Gen-Einfügungsstelle flankieren, und Primer, die das eingefügte fluoreszierende Gen selbst verstärken. Verschiedene Kombinationen dieser Primer erzeugen PCR-Amplicons, die die Geneinfügung erkennen und reinheit anzeigen. Verstärken Sie virale Bestände, um PCR in einem Brunnen einer 12-Well-Plattenmonolayer von BS-C-1-Zellen gescreent werden. 24 Stunden nach der Infektion, kratzen infizierte Zellen in 250 l DMEM. Zentrifugen-infizierte Zellen (18.000 x g für 10 min, 4 °C), Überstand entfernen und Zellpellet in 500 l TE (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8) mit 0,1% (v/v) SDS wieder aufsetzen. Wirbel zu Lyse-Zellen. 500 l Phenol-Chloroform-Isoamyl-Akohol hinzufügen, invertieren, um zu mischen. Zentrifuge (18.000 x g für 4 min, 4 °C). Nehmen Sie den Überstand und wiederholen Sie ihn. Führen Sie eine Ethanolfällung auf den Überstand durch Zugabe von 1 ml 100% Ethanol (gekühlt) und 50 l Natriumacetat, invertieren zu mischen. Bei -20 °C über Nacht oder -80 °C für 1 Stunde lassen. Zentrifuge (18.000 x g für 30 min, 4 °C), entfernen Sie alle Flüssigkeiten und lassen gefällte DNA lufttrocknen. Resuspend in 50 l TE. Verwenden Sie dies als Vorlage für das genomische DNA-PCR-Screening. 3. Generierung von rekombinanten Viren, die mehr als ein Tag tragen Koinfizieren Sie dieselbe Zellmonoschicht mit fluoreszierenden rekombinanten Viren, um doppel- oder dreifach markierte Viren oder Wiederholungsprozeduren aus Protokoll 1) mit einem anderen Tag zu erzeugen. Reinigen Sie Viren auf der Grundlage von Plaque-Phänotyp oder PCR-Screening von Virusisolat genomische DNA.

Representative Results

Abbildung 1 listet die verschiedenen Konstrukte auf, die für dieses Verfahren erforderlich sind, die entweder synthetisiert (Abbildungen 1b und 1c) oder durch Klonschritte erstellt werden (Abbildung 1d). Abbildung 2 gibt einen Überblick über das experimentelle Verfahren mit repräsentativen fluoreszierenden Plaquebildern eines A3-GFP-rekombinanten VACV, das für jeden Schritt des Auswahlprozesses dargestellt wird. In Abbildung 3werden rekombinante Impfviren gezeigt, die Proteine exmittierten, die mit fluoreszierenden Markern markiert sind, die auf virale Strukturproteine A3 und F13 abzielen, die Teil des inneren Viruskerns23 bzw. der äußeren Hülle24sind. Beobachtungen von Virusplaques und infizierten Zellen für jedes der erzeugten rekombinanten Viren werden dargestellt. Die Effizienz der homologen Rekombination von Vektoren mit dem VACV-Genom, das so wenig wie 70 bp Homologiebereiche enthält, wurde getestet und die Ergebnisse sind in Abbildung 4dargestellt. Der relative Erfolg der Identifizierung viraler Plaques, die aus der Rekombination mit Vektoren mit 100 bp Homologie hergestellt wurden, war der Grund für die Entscheidung, 150 bp Länge links und rechts der Homologie zum Zielgen zu synthetisieren. Abbildung 1. Transient Dominant Selection (TDS) Rekombinationsvektor. (a) TDS-Vektor mit gpt- und mCherry-Auswahlmarkern. (b) Die linken und rechten Arme der Homologie sind mit spezifischen Restriktionsstellen dazwischen und flankierend auf die Arme der Homologie ausgelegt. Restriktionsstellen zwischen dem linken und rechten Arm, die bei dieser Methode verwendet wurden, waren NotI und BamHI, wobei die NotI-Site auch als Bindeglied zwischen dem Gen und dem fluoreszierenden Tag verwendet wurde. (c) Fluoreszierende Tags, die mit dieser Methode kompatibel sind, werden von entsprechenden Einschränkungsstellen flankiert. Einige Tags sind GFP (grünes fluoreszierendes Protein), RFP (rotes fluoreszierendes Protein), Cerulean (eine Verbesserung gegenüber ECFP, einem Cyan-Fluoreszenzprotein, durch standortgesteuerte Mutagenese25) und Mini-SOG, ein fluoreszierendes Protein aus GFP, das ein Produkt erzeugt, das von EM auf Beleuchtung aufbereitet wird26. (d) Klonschritte bei der Erzeugung des endgültigen TDS-Rekombinationsvektors. Das synthetisierte Oligonukleotid, das die linken und rechten Flankenarme enthält, wird zuerst in den TDS-Vektor geklont. Dies bietet einen Rekombinationsvektor, in den jedes Tag ihrer Wahl durch Klonen in die Zwischenhalteflächen zwischen dem linken und rechten Arm ein- und ausgegliedert werden kann. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. Abbildung 2. Gliederung des experimentellen Verfahrens zur Erstellung eines rekombinanten Impfungsvirus. Ereignisse, die auf genetischer und zellulärer Ebene auftreten, werden dargestellt, zusammen mit repräsentativen Plaque-Bildern, die die Schritte nach der Entstehung eines A3-GFP-markierten fluoreszierenden Impfvirus skizzieren. (A) Zellen, die mit dem Impfvirus infiziert sind, werden mit dem TDS-Rekombinationsvektor transfiziert. (B) In dieser Abbildung wird nur das Ergebnis der Linksrekombination dargestellt, und das Beispiel verwendet GFP als fluoreszierendes Tag der Wahl. Eine Rechtsrekombination würde dazu führen, dass das gesamte TDS-Plasmid in ähnlicher Weise in das Genom integriert wird, außer dass das Tag im Zwischenschritt, d. h. Schritt C, mit dem gesamten Zielgen verschmolzen würde. Ein Plaque-Assay wird auf einer Zellmonolayer mit dem Rekombinationsmix durchgeführt und der GPT-Auswahl unterzogen. (C) Plaques mit roter und grüner Fluoreszenz, die dem mCherry- bzw. GFP-Ausdruck entsprechen, werden gepflückt und verstärkt. Sobald die Selektion entfernt ist, wird es einen Verlust der roten Fluoreszenz geben, der dem Verlust der gpt- und mCherry-Gene (D) entspricht, und Plaques, die ausschließlich grüne Fluoreszenz aufweisen, werden gepflückt und verstärkt (E). Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse des TDS-Rekombinationssystems. Die Bilder zeigen ganze Plaques rekombinanter VACV-Infektionszellen nach 48 Stunden(a, c, e; Scale bar 100 m), begleitet von einem Bild einer einzelnen Zelle, die nach 8 Stunden mit dem entsprechenden rekombinanten Virus infiziert ist (b, d, f; Scale bar 10 m). Gene, die Virionen-lokalisierten Proteinen entsprechen, wurden ausgewählt, um Viruspartikel zu visualisieren. A3 ist ein Kernprotein der Vaknia virion (a, b) und F13 (c, d) ist ein virales Umschlagprotein. Ein doppelt markiertes Virus mit fluoreszierend a3 und F13 (e, f) wird ebenfalls gezeigt. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. Abbildung 4. Quantitative Analyse der Rekombinationseffizienz zwischen rekombinanten Vektoren und dem VACV-Genom. BS-C-1-Monolayer wurden mit VACV infiziert und transfizierten 1 Stunde nach der Infektion mit drei Rekombinationsvektoren, die Homologiebereiche von entweder 500 bp, 100 bp oder 70 bp zum VACV-Genom enthielten. Jeder Vektor enthielt auch die TDS-Kassette, die gpt- und mCherry-Selektionsgene enthielt. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Infektion geborgen und lysiert, um die gebildeten rekombinanten Viren freizusetzen. Plaque-Assays wurden an Zelllysaten mit GPT-Auswahlmedien durchgeführt und Plaques, die mCherry Fluoreszenz zeigten, wurden als erfolgreiche Rekombinanten gezählt. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen. Abbildung 5. Karte des gpt-mCherry TDS-Vektors, der die Multiple-Klon-Site anzeigt. Der Vektor wurde zuvor22 beschrieben und die Vektorkarte wurde mit Hilfe von EZ Plasmid Map v1.9 von der Zhang Lab Group (SCU) erstellt. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.

Discussion

Diese Technik beschreibt ein effizientes und modulares Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Viren, die fluoreszierend markierte virale Proteine ausdrücken. Die Methode stellt sicher, dass die einzige Änderung am viralen Genom die Hinzufügung eines Tags oder Markers ist, sodass keine Auswahlmarker zurückbleiben. Die kurze Armlänge, die für die homologe Rekombination erforderlich ist, ermöglicht seine direkte Synthese, wodurch mehrere zeitaufwändige Runden pcR und Klonen eliminiert werden, während die Fluoreszenz von mCherry und metabolische GPT-Auswahl verwendet werden, um virale Rekombinationszwischenprodukte zu isolieren. Diese Zwischenprodukte können nach der Entfernung der Selektion zu einem Virus mit einem markierten Gen oder zurück zum elterlichen Typ aufgelöst werden. Eine ähnliche Methode, bei der sowohl fluoreszierende als auch metabolische Selektion verwendet wird, wurde zuvor²⁷ beschrieben, obwohl die in dieser Studie verwendete Methode kürzere, synthetisierte Homologiebereiche nutzt, die die Identifizierung des gewünschten rekombinanten Virus ermöglichen, indem die Fluoreszenz des markierten Gens von Interesse geschildert wird. Diese sekundäre Auswahl ist nur für die Kennzeichnung hochexprimierter viraler Gene anwendbar, die in einem Plaque-Assay eine ausreichende Fluoreszenz erzeugen. Alternativ könnte man sich vorstellen, eine vollständige Expressionskassette einzufügen, zum Beispiel ein fluoreszierendes Protein unter einem starken viralen Promotor. In diesem Fall würden die linken und rechten Arme den Einfügepunkt definieren und nicht das virale Gen, das markiert werden soll.

Es gibt einige wichtige Schritte, die sich während des experimentellen Verfahrens als hilfreich erwiesen haben. Die oben beschriebene Flüssigkeitsüberlagerung in Schritt 2.3.3 erwies sich als entscheidend für den Nachweis und die Isolierung von rot-grünen Fluoreszenz-Plaques. Wir glauben, dass die Kombination der GPT-Auswahlreagenzien und Agarose-Overlay das Wachstum rekombinanter Viren abschreckte und daher für den ersten Schritt der Verstärkung von Viren nach der Transfektion auf ein flüssiges Overlay umgestellt wurde. Es ist auch wichtig, fluoreszierende Plaques zu wählen, die lokalisierte Tag-Farbfluoreszenz zur Anreicherung und Reinigung zeigen, da Zwischenprodukte, die durch die Rekombination des linken Arms entstehen, zu einer diffusen Fluoreszenz führen können, die in Plaques beobachtet wird, wenn der linke Arm auch eine Promotorsequenz enthält. Das mCherry-Markergen im TDS-Vektor kann beispielsweise auch durch gfpersetzt werden, um die einfache Einbindung und Auswahl von mCherry als fluoreszierendes Tag zu ermöglichen.

Einige oben beschriebene Techniken unterscheiden sich geringfügig von etablierten Methoden zur Entstehung des rekombinanten Impfvirus. Zum Beispiel ist die MOI des Virus verwendet, um Rekombinanten zu erstellen ist in der Regel weniger als 1²⁸, aber die Verwendung von höheren MOIs war ausreichend für die Schaffung von rekombinanten Vaknienvirus mit dieser Methode. Die Verwendung von GPT-Selektionsreagenzien erfordert in der Regel eine Vorinkubation der Zellen mit Selektionsreagenzien¹⁸, allerdings bietet die Zugabe während der Rettungsphase nach der Infektion noch eine ausreichende Auswahl an gewünschten Rekombinanten, insbesondere aufgrund des Vorhandenseins eines fluoreszierenden Selektionsmarkers.

Wie bereits erwähnt, ist eine der Einschränkungen dieser Technik, dass der sekundäre Fluoreszenzauswahlschritt davon abhängt, dass das markierte Protein von Interesse stark exprimiert wird, auf einem Niveau, das seine Erkennung durch Das Auge in einem Plaque-Assay ermöglicht. Ohne dies wäre es möglich, Viren zu reinigen, die nur mCherry-Fluoreszenz aufweisen, von denen mindestens 50% die gewünschten rekombinanten Viren enthalten würden, die durch molekulare Strategien wie PCR, wie in Schritt 2.12 beschrieben, identifiziert werden könnten. Eine weitere Einschränkung könnte die Inaktivierung bestimmter Proteine als Folge ihrer Kennzeichnung sein. Das fluoreszierende Tag kann Mutationen durchmachen oder durch das rekombinante Virus mit Passaging im Laufe der Zeit ausgeschnitten werden. Daher wird eine regelmäßige Probenahme von rekombinanten Virusbeständen durch Mikroskopie und PCR empfohlen. Schließlich kann die Anzahl der fluoreszierend markierten Proteine begrenzt werden, die in ein einzelnes Virus eingearbeitet werden können. Ein Aspekt davon ist die Fähigkeit, sie alle gleichzeitig zu visualisieren; Angesichts der Überlappung der Emissionsspektren verfügbarer Fluoreszenz-Tags ist es wichtig, sie sorgfältig auszuwählen, um eine minimale spektrale Durchblutung zu gewährleisten. Darüber hinaus eröffnet die Verwendung eng verwandter Tags wie GFP und Cerulean die Möglichkeit einer Rekombination zwischen den beiden, abhängig von ihren Positionen im rekombinanten Genom.

Der modulare Charakter dieser Technik ermöglicht die einfache Substitution von Fluoreszenz-Tags basierend auf kompatibilität mit anderen Färbungs- und/oder Tag-Optionen. Durch die Ausscheidung wählbarer Marker ermöglicht die TDS-Methode die serielle Zugabe verschiedener fluoreszierender Proteine oder die Kombination von TDS-basiertem Tagging mit TDS-basierten Genlöschungen für phänotypische Analysen²⁹. Als Beispiel für den Nutzen dieses Ansatzes wurde ein doppelt markiertes fluoreszierendes Virus erzeugt, das Viruskerne und die WV-Membran kennzeichnet. Bildgebende Studien mit diesem Virus könnten verwendet werden, um Bewegung, Morphogenese und Das Umhüllung von Viren während der Virusreplikation zu untersuchen. Noch nicht charakterisierte Impfungviralproteine können auch mit dieser Technik markiert und untersucht werden.

Das Vaccinia-Virus wurde in bildgebenden Studien aufgrund vieler Merkmale des Virus, die für die Live-Zellmikroskopie günstig sind, ausgiebig eingesetzt. Fluoreszierende Tags werden aus dem viralen Genom exprimiert, wodurch die Transfektion überflüssig wird, sodass Primärzellen, die von infizierten Tieren oder nicht transfizierbaren Zellen gewonnen wurden, leicht analysiert werden können. Anfänglich wurden fluoreszierende VACVs für die einfache subzelluläre Verfolgung der Virusbewegung³⁰verwendet, aber neuere Ansätze haben ihren Nutzen erweitert, um FRET-Studien³¹, FRAP an einzelnen Viruspartikeln³², Promoter-Reporter³³, intravitale Bildgebung³⁴und Strukturstudien^35-37. Alle diese Techniken könnten in der Nähe von einfacher und näherer Reichweite mit dieser Methode der Schaffung rekombinanter fluoreszierender Viren sein.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch das Australian Research Council Federation Discovery Project Grant #1096623 finanziert.

Materials

Mycophenolic acid	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	Dissolve in 0.1N NaOH
Xanthine	Sigma-Aldrich	X0626-5G	Dissolve in 0.1N NaoH
FuGENE HD transfection reagent	Promega	E2311
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)

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Marzook, N. B., Procter, D. J., Lynn, H., Yamamoto, Y., Horsington, J., Newsome, T. P. Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins. J. Vis. Exp. (83), e51151, doi:10.3791/51151 (2014).