JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie und Infektion

Methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld Vaccinia Virus Eiwitten

Published: January 17, 2014
doi:
10.3791/51151
, , , , ,
1School of Molecular Bioscience,University of Sydney, 2Department of Medicine,Center for Vascular Research, 3Asia Pacific Centre for Animal Health, Faculty of Veterinary Science,University of Melbourne

Summary

Een snel en modulair protocol voor het genereren van recombinante vacciniavirussen die fluorescerend gelabelde eiwitten tegelijkertijd uitdrukken met behulp van de methode van voorbijgaande dominante selectie wordt hier beschreven.

Abstract

Het taggen van virale eiwitten met fluorescerende eiwitten is een onmisbare aanpak gebleken om ons begrip van virus-gastheerinteracties te bevorderen. Vaccinia-virus (VACV), het levende vaccin dat wordt gebruikt bij de uitroeiing van pokken, is bijzonder vatbaar voor fluorescerende levendcellige microscopie vanwege de grote viriongrootte en het gemak waarmee het op genoomniveau kan worden ontworpen. We rapporteren hier een geoptimaliseerd protocol voor het genereren van recombinante virussen. De minimale vereisten voor gerichte homologe recombinatie tijdens vacciniareplicatie werden bepaald, wat de vereenvoudiging van de constructgeneratie mogelijk maakt. Dit stelde de alliantie van transient dominant selection (TDS) met een fluorescerende reporter en metabolische selectie in staat om een snelle en modulaire benadering van fluorescerende virale eiwitten te bieden. Door de generatie van fluorescerende recombinante virussen te stroomlijnen, zijn we in staat om downstream-toepassingen te vergemakkelijken, zoals geavanceerde beeldvormingsanalyse van veel aspecten van het virus-host-samenspel dat optreedt tijdens virusreplicatie.

Introduction

Vacciniavirus (VACV) is het prototypische poxvirus en zeer verwant aan het variolavirus, de veroorzaker van pokken. Beide virussen zijn leden van het orthopokkengeslacht dat andere opmerkelijke pathogenen omvat, zoals monkeypox en ectromeliavirus (mousepox)1. Orthopoxvirussen hebben grote dubbelstrengs DNA-genomen (180-220 kb) die meer dan 200 voorspelde open leesframescoderen 2,3. Replicatie van deze virussen omvat de vorming van een perinucleaire virusfabriek, waar volwassen virussen (MV) worden gemaakt, en het trans-Golgi-netwerk waar een subset van MV twee extra membranen verwerft om verpakte virussen (WV) te genereren (beoordeeld door Roberts en Smith4). Orthopox-genomen zijn zeer vatbaar voor genetische manipulatie vanwege de hoge mate van genetische recombinatie die een kenmerk is van VACV-genoomreplicatie en wordt gemedieerd door het virale DNA-polymerase5. Het genereren van recombinante virussen is afhankelijk van homologe recombinatie en lineaire DNA-moleculen met homologieën zo klein als 12 bp die voldoende zijn om recombinatie in vaccinia met het virus geïnfecteerde cellen te bemiddelen6. Fluorescerende etikettering van vacciniavirus kan extreem heldere virusdeeltjes opleveren vanwege de grote omvang van orthopokkendeeltjes, waardoor veel fluorescerende eiwitten per virion kunnen worden opgenomen7. Vaccinia heeft de capaciteit om grote fragmenten van vreemd DNA8 te vervoeren en bovendien kan het ontbreken van rigide capsid-symmetrie een zekere mate van flexibiliteit mogelijk maken bij het uitdrukken van virale eiwitgenfusies uit hun endogene loci9. Fluorescerende tagging van VACV-eiwitten is van onschatbare waarde gebleken voor de studie van gastheer-pathogene interacties op subcellulair niveau, met name op het gebied van virusinvoer10, transport11-13, en morfogenese, met name van verpakte virionen7.

Recombinante virussen kunnen worden geselecteerd door redding van een verzwakt groeifenotype14,15, metabolische selectie16-18, of door expressie van een markergen(bijv. X-gal19 of fluorescerend eiwit13,20). Hier beschrijven we de selectie van fluorescerende virussen met behulp van een krachtige combinatie van fluorescerende en metabolische selectie. Transient dominant selection (TDS) vectoren, ontwikkeld door Faulkner en Moss (1990)21, maken het mogelijk markers te integreren samen met het gewenste fluorescerend gelabelde gen van belang. Wanneer metabolische selectie wordt verwijderd, kan een secundaire recombinatiegebeurtenis optreden die de selectiegenen verwijdert, maar het fluorescerend gelabelde viruseiwit intact laat. Figuur 2 hieronder geeft een overzicht van de experimentele procedure. De selectiegenen die in deze studie worden gebruikt, zijn mCherry en het Escherichia coli guanine phosphoribosyltransferase (gpt) gen, beide uitgedrukt uit een synthetische vroege/late virale promotor en eerder gebruikt door Cordeiro et al. 22 Bovendien is er fluorescentie van het getagde fusie-eiwit van belang. Wanneer metabolische selectie wordt verwijderd, worden de selecteerbare markers (mCherry en gpt ) verwijderd, waardoor alleen de fluorescentie van het gelabelde gen overblijft,waardoor de juiste recombinante virussen kunnen worden geïdentificeerd. De excisie van de selectiemarkers biedt de mogelijkheid om meerdere fluorescerende tags te combineren, waardoor we virussen kunnen maken met de mogelijkheid om meerdere virale eiwitten tegelijkertijd fluorescerend te labelen. Eerdere studies hebben de minimale homologische vereisten bepaald voor vaccinia recombinatie van lineaire en circulaire DNA-moleculen getransfecteerd in vaccinia virus geïnfecteerde cellen6. We wilden de recombinatie-efficiëntie bepalen van verschillende homologielengtes van flankerende armen in de gpt-mCherry TDS-vector door de opname ervan in het vaccinia virale genoom. Er werd vastgesteld dat homologe gebieden van 100 bp in de TDS-vector voldoende zijn om het inbrengen van recombinant DNA in het VACV-genoom te richten en te bemiddelen door homologe recombinatie (figuur 4). Terwijl kleinere homologielengtes ook recombinatie mogelijk zouden maken, zorgden homologielengtes van 100 bp voor voldoende recombinante virussen die gemakkelijk konden worden geïdentificeerd met metabolische en fluorescerende selectie. DNA-fragmenten van deze grootte kunnen commercieel worden gesynthetiseerd tegen relatief lage kosten en vergemakkelijken de productie van meerdere vectoren voor de creatie van recombinante virussen aanzienlijk. We hebben ervoor gekozen om de homologielengte te verhogen tot 150 bp om een grotere recombinatiefrequentie te bieden en tegelijkertijd de kosten van synthese van de oligonucleotidesequentie van flankerende regio’s te beperken.

Protocol

1. De recombinatievector maken Identificeer 150 bp lange flankerende gebieden van homologie (aangeduid als de linker- en rechterarmen) die nodig zijn om het virale gen van belang N- of C-terminaal te labelen (zie figuur 1b). Ontwerp een oligonucleotidesequentie bestaande uit de linker- en rechterarmen van 150 bp, gescheiden door een paar beperkingsplaatsen naar keuze. Deze hele reeks moet ook worden geflankeerd door een tweede paar beperkingssites (anders dan het eerste paar) om opname in de TDS-vector mogelijk te maken zodra deze is gesynthetiseerd. Wees voorzichtig bij het ontwerpen van het oligonucleotide met beperkingssites dat de sequenties in beeld zijn met de gewenste invoegplaats. Neem bij het ontwerpen van het oligonucleotide voor synthese beperkingsplaatsen tussen de linker- en rechterarm op, die moeten overeenkomen met die welke het open leeskader van de fluorescerende tag naar keuze flankeren (zie figuur 1b). Het is mogelijk om een NotI-beperkingsplaats te gebruiken als een drie aminozuur linker tussen de linkerarm en het begin van de fluorescerende tag. Neem dezelfde beperkingssites op aan weerszijden van de fluorescerende tag door PCR (zie figuur 1c). Kloon het gesynthetiseerde fragment in de TDS-vector. Kloon de fluorescerende tag in de resulterende recombinatievector met behulp van de beperkingssites tussen de linker- en rechterarmgebieden van homologie (zie figuur 1d). 2. Recombinant Virus Generatie Volgens figuur 2,infecteer een monolaag van BS-C-1 cellen met vaccinia virus in serumvrije media bij een Multiplicity of Infection (MOI) > 1. 1 uur na infectie, reddingscellen met Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) en transfect met een mengsel van recombinatievectorplasmide en transfectiereagens in een verhouding van 3:1 in serumvrije media. Schraap en herstel na 24 uur cellen in DMEM die geen foetale runderserum (FBS) bevatten en voer drie vries-dooicycli uit om open cellen te breken en virusdeeltjes vrij te geven. Voer een plaquetest uit met een vloeibare overlay van 10% FBS DMEM en GPT selectiereagentia mycophenolzuur (25 μg/ml) en xanthine (250 μg/ml) als volgt: Zaai een 6-well plaat met een monolaag van BS-C-1 cellen. Infecteer 100% samenvloeiende celmonolagen met seriële verdunningen van de met bevriezing ontdooide cellen die virusdeeltjes bevatten om een adequate scheiding van individuele plaques te garanderen. Overlay met vloeibare 10% FBS die DMEM bevat die de GPT-selectiereagentia bevatten – mycophenolzuur en xanthine bij eindconcentraties van respectievelijk 25 μg/ml en 250 μg/ml. Verwijder na een incubatie van 24 uur de vloeibare overlay en gebruik een fluorescerende microscoop om te zoeken naar plaques met diffuse rode fluorescentie die overeenkomen met de opname van mCherry uit de TDS-vector in het virus. Afhankelijk van het doelgen en de gekozen fluorescerende tag kan lokale fluorescentie van het gelabelde gen ook worden waargenomen in dezelfde rode plaque. Kies meerdere plaques voor elk recombinantvirus door gelokaliseerd schrapen met een pipetpunt en 100 μl 5% FBS met DMEM om cellen over te brengen naar een Eppendorf-buis, gevolgd door drie rondes vries-ontdooien van geschraapte cellen om recombinante virussen vrij te geven. Voeg de DMEM met freeze-thawed virus toe aan een monolaag van cellen in een 12-well plaat om recombinante virussen te versterken met GPT-selectiereagentia in de groeimedia. Schraap succesvolle versterkingen 24 uur na infectie. Voer een plaquetest uit van met succes versterkte plaques met rode fluorescentie, dit keer met een agarose-overlay en GPT-selectie, als volgt: Zaai een 6-well plaat met een monolaag van BS-C-1 cellen. Voer een seriële verdunning van de recombinante virussen uit en infecteer putten met een toenemende verdunning van virussen in FBS-vrije DMEM. 1 uur na infectie, verwijder de vloeibare media en belaag elke put met 0,5% agarose in minimaal essentieel medium (MEM) met 2,5% FBS, 292 μg/ml L-glutamine, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine, samen met de GPT-selectiereagentia. 2-3 dagen na infectie, kies plaques met fluorescentie die zowel rood is als de kleur van de gekozen fluorescerende tag om opnieuw te versterken, dit keer zonder GPT-selectie. Voer de volgende plaquetest uit met een agarose-overlay zonder selectie. Kies plaquettes die hun diffuse rode fluorescentie hebben verloren, maar de gelokaliseerde fluorescentie behouden die overeenkomt met de tag van keuze. Ga door met plaquezuiveren zonder selectie om een zuivere voorraad recombinante virussen te verkrijgen die de mCherry- en gpt-selectiegenen hebben verloren, maar de gelokaliseerde fluorescentie behouden die overeenkomt met de gekozen tag. Controleer of de voorraden zuiver zijn door plaquetest, alle plaques moeten een vergelijkbaar plaquefenotype hebben. Gebruik PCR-screening van genomisch DNA om ervoor te zorgen dat virale voorraden zuiver zijn. Ontwerp primers die de fluorescerende geninvoegplaats flankeren en primers die het ingevoegde fluorescerende gen zelf versterken. Verschillende combinaties van deze primers produceren PCR-amplicons die geninvoeging detecteren en zuiverheid aangeven. Versterken virale voorraden te worden PCR gescreend in een put van een 12-put plaat monolayer van BS-C-1 cellen. 24 uur na infectie geïnfecteerde cellen in 250 μl DMEM schrapen. Centrifugeer geïnfecteerde cellen (18.000 x g gedurende 10 min, 4 °C), verwijder supernatans en resuspend celkorrel in 500 μl TE (10 mM Tris-HCl en 1 mM EDTA, pH 8) met 0,1% (v/v) SDS. Vortex aan lyse cellen. Voeg 500 μl fenol-chloroform-isoamyl acohol toe, omkeren om te mengen. Centrifugeer (18.000 x g gedurende 4 min, 4 °C). Neem de supernatant en herhaal. Voer een ethanolprecipitatie uit op het supernatant door 1 ml 100% ethanol (gekoeld) en 50 μl natriumacetaat toe te voegen, omkeren om te mengen. Laat ‘s nachts bij -20 °C of -80 °C gedurende 1 uur staan. Centrifugeer (18.000 x g gedurende 30 min, 4 °C), verwijder alle vloeistof en laat neergeslagen DNA aan de lucht drogen. Resuspend in 50 μl TE. Gebruik dit als sjabloon voor genomische DNA PCR-screening. 3. Generatie van recombinante virussen die meer dan één tag dragen Coinfect dezelfde cel monolayer met fluorescerende recombinante virussen om dubbel- of triple-label virussen te creëren of herhaal procedure van Protocol 1) met een andere tag. Zuiver virussen op basis van plaquefenotype of PCR-screening van virusisolaat genomisch DNA.

Representative Results

Figuur 1 geeft een overzicht van de verschillende constructies die nodig zijn voor deze procedure, die ofwel worden gesynthetiseerd (figuren 1b en 1c) of worden gemaakt door kloonstappen (figuur 1d). Figuur 2 geeft een overzicht van de experimentele procedure met representatieve fluorescerende plaquettebeelden van een A3-GFP recombinant VACV afgebeeld voor elke stap van het selectieproces. In figuur 3worden recombinante vacciniavirussen weergegeven die eiwitten uitdrukken die zijn gelabeld met fluorescerende markers gericht op virale structurele eiwitten A3 en F13, die respectievelijk deel uitmaken van de binnenste viruskern23 en buitenste envelop24. Waarnemingen van virale plaques en geïnfecteerde cellen voor elk van de gecreëerde recombinante virussen worden afgebeeld. De efficiëntie van homologe recombinatie van vectoren met het VACV-genoom, dat slechts 70 bp-gebieden van homologie bevat, werd getest en de resultaten zijn weergegeven in figuur 4. Het relatieve succes van het identificeren van virale plaques gemaakt van recombinatie met vectoren die homologie van 100 bp bevatten, was de redenering achter de keuze om 150 bp lengte linker- en rechterarmen van homologie te synthetiseren naar het doelgen. Figuur 1. Transient Dominant Selection (TDS) recombinatievector. (a) TDS-vector met gpt- en mCherry-selectiemarkeringen. ( b) Linker- en rechterarmen van homologie zijn ontworpen met specifieke beperkingsplaatsen tussen en flankerend van de armen van homologie. Beperkingsplaatsen tussen de linker- en rechterarmen die bij deze methode werden gebruikt, waren NotI en BamHI, waarbij de NotI-site ook werd gebruikt als linker tussen het gen en de fluorescerende tag. (c) Fluorescerende tags die compatibel zijn met deze methode worden geflankeerd door overeenkomstige beperkingssites. Enkele gebruikte tags zijn GFP (groen fluorescerend eiwit), RFP (rood fluorescerend eiwit), Cerulean (een verbetering ten opzichte van ECFP, een cyaan fluorescerend eiwit, door site-directed mutagenese25) en mini-SOG, een fluorescerend eiwit ontworpen uit GFP dat een product creëert dat door EM kan worden opgelost op verlichting26. d) Kloonstappen die betrokken zijn bij het genereren van de uiteindelijke TDS-recombinatievector. Het gesynthetiseerde oligonucleotide met de linker- en rechterflankarmen wordt eerst gekloond in de TDS-vector. Dit biedt een recombinatievector waarin elke tag naar keuze in en uit kan worden geshuwd door te klonen naar de beperkingssites die tussen de linker- en rechterarm zijn opgenomen. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken. Figuur 2. Overzicht van de experimentele procedure om een recombinant vacciniavirus te creëren. Gebeurtenissen die zich voordoen op genetisch en cellulair niveau worden afgebeeld, samen met representatieve plaque-afbeeldingen die de stappen na de creatie van een A3-GFP-gelabeld fluorescerend vacciniavirus weergeven. (A) Cellen die besmet zijn met het vacciniavirus worden getransfecteerd met de TDS-recombinatievector. (B) In deze afbeelding wordt alleen het resultaat van linkse recombinatie weergegeven en in het voorbeeld wordt GFP gebruikt als de fluorescerende tag naar keuze. Rechtse recombinatie zou ertoe leiden dat de gehele TDS plasmide op een vergelijkbare manier in het genoom wordt opgenomen, behalve dat de tag in de tussenstap, d.w.z. stap C, wordt versmolten met het hele doelgen. Een plaquetest wordt uitgevoerd op een celmonolaag met de recombinatiemix en onderworpen aan GPT-selectie. (C) Plaquettes met zowel rode als groene fluorescentie, die overeenkomen met respectievelijk mCherry- en GFP-expressie, worden geplukt en versterkt. Zodra de selectie is verwijderd, zal er verlies van rode fluorescentie zijn die overeenkomt met het verlies van de gpt- en mCherrygenen (D) en plaques met uitsluitend groene fluorescentie worden geplukt en versterkt (E). Klik hier om grotere afbeelding te bekijken. Figuur 3. Representatieve resultaten van het TDS-recombinatiesysteem. Afbeeldingen tonen hele plaques van recombinante VACV-infecterende cellen na 48 uur (a, c, e; schaalbalk 100 μm), vergezeld van een afbeelding van een enkele cel die na 8 uur is geïnfecteerd door het overeenkomstige recombinantvirus (b, d, f; schaalbalk 10 μm). Genen die overeenkomen met virion-gelokaliseerde eiwitten werden geselecteerd om virusdeeltjes te visualiseren. A3 is een kerneiwit van de vaccinia virion (a, b) en F13 (c, d) is een virale envelop eiwit. Er wordt ook een dubbel gelabeld virus met zowel fluorescerend gelabeld A3 als F13 (e, f) weergegeven. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken. Figuur 4. Kwantitatieve analyse van recombinatie-efficiëntie tussen recombinante vectoren en het VACV-genoom. BS-C-1 monolagen werden geïnfecteerd met VACV en 1 uur na infectie getransfecteerd met drie recombinatievectoren die homologiegebieden van 500 bp, 100 bp of 70 bp bevatten naar het VACV-genoom. Elke vector bevatte ook de TDS-cassette bestaande uit gpt- en mCherry-selectiegenen. Cellen werden 24 uur na infectie hersteld en gelyseerd om de gevormde recombinante virussen vrij te geven. Plaquetesten werden uitgevoerd op cellysaten met GPT-selectiemedia en plaques met mCherry-fluorescentie werden geteld als succesvolle recombinanten. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken. Figuur 5. Kaart van de gpt-mCherry TDS vector die de meervoudige kloonsite toont. De vector is eerder beschreven22 en de vectorkaart is gemaakt met behulp van EZ Plasmid Map v1.9 van de Zhang Lab Group (SCU). Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.

Discussion

Deze techniek beschrijft een efficiënt en modulair protocol voor het creëren van recombinante virussen die fluorescerend gelabelde virale eiwitten uitdrukken. De methode zorgt ervoor dat de enige verandering in het virale genoom de toevoeging van een tag of marker is, waardoor er geen selectiemarkers achterblijven. De korte armlengte die nodig is voor homologe recombinatie maakt de directe synthese mogelijk, waardoor verschillende tijdrovende rondes PCR en klonen worden geëlimineerd, terwijl de fluorescentie van mCherry en metabole GPT-selectie worden gebruikt om virale recombinatie-tussenproducten te isoleren. Deze tussenproducten kunnen, na het verwijderen van de selectie, worden opgelost naar een virus met een gelabeld gen of terug naar het ouderlijk type. Een vergelijkbare methode met het gebruik van zowel fluorescerende als metabolische selectie is eerder beschreven27, hoewel de methode die in deze studie wordt gebruikt kortere, gesynthetiseerde gebieden van homologie gebruikt, waardoor de identificatie van het gewenste recombinante virus mogelijk is door de fluorescentie van het gelabelde gen van belang in beeld te brengen. Deze secundaire selectie is alleen van toepassing op het taggen van sterk uitgedrukte virale genen die voldoende fluorescentie produceren in een plaquetest. Als alternatief zou men kunnen overwegen om een complete expressiecassette in te voegen, bijvoorbeeld een fluorescerend eiwit onder een sterke virale promotor. In dit geval zouden de linker- en rechterarm het invoegpunt definiëren in plaats van het virale gen dat moet worden getagd.

Er zijn enkele belangrijke stappen die nuttig bleken tijdens de experimentele procedure. De hierboven beschreven vloeistofoverlay in stap 2.3.3 bleek cruciaal voor de detectie en isolatie van rood/groene fluorescerende plaquettes. Wij zijn van mening dat de combinatie van de GPT-selectiereagentia en agarose-overlay de groei van recombinante virussen afschrikte en daarom overschakelde op een vloeibare overlay voor de eerste stap van het versterken van virussen na transfectie. Het is ook belangrijk om fluorescerende plaques te kiezen met gelokaliseerde tagkleurfluorescentie voor verrijking en zuivering, omdat tussenproducten als gevolg van recombinatie van de linkerarm kunnen resulteren in diffuse fluorescentie waargenomen in plaques als de linkerarm ook een promotorsequentie bevat. Het mCherry-markergen in de TDS-vector kan ook worden vervangen door gfp,bijvoorbeeld om de eenvoudige integratie en selectie van mCherry als fluorescerende tag mogelijk te maken.

Sommige hierboven beschreven technieken verschillen enigszins van de vastgestelde methoden voor het creëren van recombinant vacciniavirus. De MOI van het virus dat wordt gebruikt om recombinanten te maken is bijvoorbeeld normaal gesproken minder dan 128, maar het gebruik van hogere MOIs is voldoende geweest voor het creëren van recombinant vaccinia-virus met deze methode. Het gebruik van GPT-selectiereagentia vereist normaal gesproken pre-incubatie van de cellen met selectiereagentia18, maar het toevoegen ervan tijdens de reddingsfase na infectie bood nog steeds voldoende selectie van gewenste recombinanten, vooral vanwege de aanwezigheid van een fluorescerende selectiemarker.

Zoals eerder vermeld, is een van de beperkingen van deze techniek dat de secundaire fluorescentieselectiestap afhankelijk is van het feit dat het gelabelde eiwit van belang sterk wordt uitgedrukt, op een niveau dat de detectie ervan door het oog in een plaquetest mogelijk maakt. Zonder dit zou het mogelijk zijn om virussen te zuiveren die alleen mCherry fluorescentie vertoonden, waarvan ten minste 50% de gewenste recombinante virussen zou bevatten, die kunnen worden geïdentificeerd door moleculaire strategieën zoals PCR beschreven in stap 2.12 hierboven. Een andere beperking zou de inactivatie van bepaalde eiwitten kunnen zijn als gevolg van hun tagging. De fluorescerende tag kan mutaties ondergaan of door het recombinante virus worden verwijderd met passaging in de loop van de tijd. Daarom wordt regelmatige bemonstering van recombinante virusvoorraden door microscopie en PCR aanbevolen. Ten slotte kan er een limiet zijn aan het aantal fluorescerend gelabelde eiwitten dat in één virus kan worden opgenomen. Een aspect hiervan is het vermogen om ze allemaal tegelijkertijd te visualiseren; gezien de overlappende aard van emissiespectra van beschikbare fluorescerende tags, is het belangrijk om ze zorgvuldig te selecteren om een minimale spectrale doorbloeding te garanderen. Bovendien opent het gebruik van nauw verwante tags zoals GFP en Cerulean de mogelijkheid van recombinatie tussen de twee, afhankelijk van hun locaties in het recombinante genoom.

Het modulaire karakter van deze techniek maakt het mogelijk om fluorescerende tags eenvoudig te vervangen op basis van compatibiliteit met andere kleurings- en/of tagkeuzes. Door selecteerbare markers te exciseren, maakt de TDS-methode de seriële toevoeging van verschillende fluorescerende eiwitten of de combinatie van TDS-gebaseerde tagging met op TDS gebaseerde gendeleties voor fenotypische analyses29mogelijk. Als voorbeeld voor het nut van deze aanpak werd een dubbel gelabeld fluorescerend virus gegenereerd dat viruskernen en het WV-membraan labelt. Beeldvormingsstudies met dit virus kunnen worden gebruikt om beweging, morfogenese en verpakking van het virus tijdens virusreplicatie te bestuderen. Tot nu toe kunnen niet-gekarakteriseerde vaccinia virale eiwitten ook worden getagd en bestudeerd door deze techniek.

Vaccinia virus is uitgebreid gebruikt in beeldvormingsstudies als gevolg van vele kenmerken van het virus die gunstig zijn voor live-cell microscopie. Fluorescerende tags worden uitgedrukt uit het virale genoom, waardoor transfectie niet nodig is, waardoor primaire cellen afkomstig van geïnfecteerde dieren of niet-overdraagbare cellen gemakkelijk kunnen worden geanalyseerd. Aanvankelijk werden fluorescerende VACV’s gebruikt voor eenvoudige subcellulaire tracking van virusbeweging30, maar recentere benaderingen hebben hun nut uitgebreid met FRET-studies31, FRAP bij enkele virusdeeltjes32, promotorverslaggevers33, intravitale beeldvorming34en structurele studies35-37. Al deze technieken kunnen binnen een gemakkelijker en dichter bereik in combinatie met deze methode van het creëren van recombinante fluorescerende virussen.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door de Australian Research Council Federation Discovery Project grant #1096623.

Materials

Mycophenolic acid Sigma-Aldrich M3536-50MG Dissolve in 0.1N NaOH
Xanthine Sigma-Aldrich X0626-5G Dissolve in 0.1N NaoH
FuGENE HD transfection reagent Promega E2311
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 Olympus, Chroma BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Fenner, F. Adventures with poxviruses of vertebrates. FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).
  2. Goebel, S. J., et al. The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus. Virology. 179, 247-266 (1990).
  3. Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat. J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).
  4. Roberts, K. L., Smith, G. L. Vaccinia virus morphogenesis and dissemination. Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).
  5. Gammon, D. B., Evans, D. H. The 3 ‘-to-5 ‘ Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination. J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).
  6. Yao, X. D., Evans, D. H. Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination. J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).
  7. Ward, B., Isaacs, S. N. . Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. 16, 205-218 (2004).
  8. Smith, G. L., Moss, B. Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000. Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).
  9. Heuser, J. Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic "honeycomb" surface coat. J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).
  10. Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. Poxvirus host cell entry. Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).
  11. Ward, B. M. Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions. J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).
  12. Carter, G. C., et al. Vaccinia virus cores are transported on microtubules. J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).
  13. Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).
  14. Rodriguez, J. F., Esteban, M. Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants. J. Virol. 63, 997-1001 (1989).
  15. Blasco, R., Moss, B. Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation. Gene. 158, 157-162 (1995).
  16. Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus – a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).
  17. Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression. Gene. 47, 193-199 (1986).
  18. Falkner, F. G., Moss, B. Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors. J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).
  19. Liu, G. Q., et al. Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker. Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).
  20. Domínguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).
  21. Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).
  22. Cordeiro, J. V., et al. F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection. Plos One. 4, (2009).
  23. Jensen, O. N., et al. Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis. J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).
  24. Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen. J. Virol. 58, 757-764 (1986).
  25. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for. 22, 445-449 (2004).
  26. Shu, X. K., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. Plos Biol. 9, (2011).
  27. Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection. J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).
  28. Broder, C. C., Earl, P. L. . 62, 173-197 (1997).
  29. Blasco, R., Moss, B. Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein. J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).
  30. Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J., Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus. Viral Transport, Assembly and Egress. , 155-177 (2011).
  31. Jeshtadi, A., et al. Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).
  32. Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility. Nature. 458, (2009).
  33. Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).
  34. Dénes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors. Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).
  35. Humphries, A. C., et al. Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread. Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).
  36. Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy. J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).
  37. Horsington, J., et al. A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus. PLoS Pathog. 9, (2013).

Tags

Fluorescent Protein TaggingVaccinia VirusRecombinant Virus GenerationHomologous RecombinationTransient Dominant SelectionMetabolic SelectionLive-cell MicroscopyVirus-host Interactions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Marzook, N. B., Procter, D. J., Lynn, H., Yamamoto, Y., Horsington, J., Newsome, T. P. Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins. J. Vis. Exp. (83), e51151, doi:10.3791/51151 (2014).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image