Mínimamente Invasiva Establecimiento de murino ortotópico xenoinjertos vejiga
Summary
La técnica establecida para inocular ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios requiere laparotomía y la movilización de la vejiga. Este procedimiento inflige una morbilidad significativa en los ratones, es técnicamente difícil y consume mucho tiempo. Lo tanto, desarrolló una alta precisión, abordaje percutáneo utilizando la guía del ultrasonido.
Abstract
Ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga son el estándar de oro para estudiar las manipulaciones celulares moleculares y nuevos agentes terapéuticos in vivo. Las líneas celulares adecuadas se inoculan ya sea mediante instilación intravesical (modelo de crecimiento invasivo no muscular) o la inyección intramural en la pared de la vejiga (modelo de crecimiento invasivo). Ambos procedimientos son complejos y altamente consume mucho tiempo. Además, el modelo superficial tiene sus deficiencias debido a la falta de líneas de células que son tumorigénicas después de la instilación. Inyección intramural, por otro lado, está estropeada por la invasividad del procedimiento y la morbilidad asociada para el ratón huésped.
Con estas limitaciones en mente, hemos modificado los métodos anteriores para desarrollar un abordaje mínimamente invasivo para la creación ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga. Usando la guía del ultrasonido que hemos realizado con éxito la inoculación percutánea de las líneas celulares de cáncer de vejiga UM-UC1, UM-UC3 y UM-UC13 en 50 desnudos atímicos. Hemos sido capaces de demostrar que este enfoque es tiempo eficiente, precisa y segura. Con esta técnica, se crea inicialmente un espacio debajo de la mucosa de la vejiga con PBS, y las células tumorales se inyectan en este espacio en un segundo paso. El crecimiento tumoral se monitorizó a intervalos regulares con imágenes de bioluminiscencia y ultrasonido. Los volúmenes promedio de tumor aumentaron constantemente en en todo menos en una de nuestras 50 ratones durante el periodo de estudio.
En nuestra institución, este nuevo enfoque, que permite la inoculación de xenoinjertos de cáncer de vejiga de una manera mínimamente invasiva, rápida y muy precisa, se ha sustituido el modelo tradicional.
Introduction
La investigación del cáncer depende de los modelos animales de cáncer humano utilizando líneas celulares derivadas de tumores de pacientes con el fin de profundizar nuestra comprensión de la biología del tumor. Para análisis in vivo el crecimiento de bajo diferentes estrategias de tratamiento de cáncer de vejiga modelos murino ortotópico siguen siendo el estándar de referencia 1,2. La inoculación de células de cáncer de vejiga humano en ratones inmunocomprometidos (modelo de xenoinjerto) se basa en la instilación intravesical ("modelo intravesical") 3,4,5 o inyección directa en la pared de la vejiga ("modelo intramural") 6,7. Ambas técnicas se pueden también realizar en ratas 8,9.
Instilación intravesical induce la formación de tumores en la superficie urotelial de la vejiga que luego son susceptibles de posterior de la instilación intravesical de agentes de tratamiento novedosas. Sin embargo, el número de líneas de células que son tumorigénicas de forma fiable cuando se entrega a través de este método se limita unaD una de esas líneas celulares, KU7, recientemente se ha demostrado ser HeLa 4,10. Instilación intravesical es también consume mucho tiempo debido a tiempos de espera necesarios, y que con frecuencia induce el crecimiento del tumor en elementos adyacentes del tracto urinario, incluyendo la uretra, uréter y pelvis renal 11. Además, la instilación intravesical a menudo conduce al crecimiento del tumor en el suelo de la vejiga donde los uréteres entran en la vejiga, y esto puede causar obstrucción de las vías superior e insuficiencia renal concomitante.
Xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios que son adecuados para tratamientos sistémicos se crean mediante inyección directa de las células tumorales en la pared de la vejiga 12. Aunque numerosas líneas celulares crecen adecuadamente en este modelo, su limitación es la invasividad de la modelo relacionado con la necesidad de una incisión abdominal 13. El modelo también es difícil de aprender debido a la dificultad técnica de la inyección de células, precisamente, en la pared muscularde la vejiga.
Un nuevo enfoque para establecer ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios en ratones se ha desarrollado en nuestro servicio con el fin de subsanar las deficiencias existentes del "modelo intramural". Hemos sido capaces de optimizar la inyección percutánea guiada por ecografía de las células de cáncer de vejiga en la pared anterior de la vejiga como resultado de esta nueva técnica para sustituir con éxito el modelo invasivo establecida. Por otra parte tenemos potencialmente hemos mejorado la precisión y reproducibilidad del "modelo intramural".
Protocol
Representative Results
Discussion
Casi todos los grandes avances en el tratamiento del cáncer requerirán pruebas en modelos animales antes de iniciar los ensayos clínicos. Los modelos animales de cáncer son herramientas esenciales que permiten a los investigadores a estudiar la biología del tumor in vivo. Modelos de xenoinjertos ortotópico siguen siendo el estándar de oro de 1,2 y siguen ofreciendo la mayor flexibilidad (en términos de la selección de líneas celulares) y tienen la utilidad más práctica.
El procedimiento ilustrado es una modificación mínimamente invasiva del modelo ortotópico descrito previamente por Dinney et al. 12 Hemos establecido tumores de xenoinjertos por ultrasonido guiado inyección percutánea de tres líneas celulares diferentes con una tasa de éxito técnico del 100%. Durante un seguimiento continuo, el 98% de los ratones demostró aumento constante en el volumen del tumor.
Mediante la realización de una técnica mínimamente invasiva, hemos sido capaces de hacer frente a las limitaciones existentes del modelo intramural. Además respenexión bienestar de los animales, la reducción de la invasividad de este procedimiento también contribuye a la reproducibilidad de los experimentos in vivo al disminuir el número de complicaciones quirúrgicas. Es altamente eficaz del tiempo para evitar una laparotomía abdominal y necesidad asociada de cierre de la herida. Hemos sido capaces de reducir considerablemente el tiempo del procedimiento por animal a 3,4 min (± 1,6). Sin embargo, la principal ventaja de nuestro enfoque novedoso es su exactitud. Ultrasonido de alta resolución nos permite visualizar el espacio creado por la inyección de solución salina bajo la mucosa de la pared de la vejiga. Esta primera inyección de paso facilita la inyección de células tumorales en un segundo paso y minimiza el riesgo de derrame de células tumorales. Esto contrasta con la técnica de inyección intramural después de la laparotomía, donde es imposible visualizar colocación de la aguja y siempre hay un elemento de incertidumbre en cuanto a la profundidad exacta de la inyección. También, ya que estamos inoculando células tumorales estrictamente en la pared anterior de la vejiga, growt tumorh en la pared posterior de la vejiga se evita. Posteriormente, la tasa de complicaciones obstructivas debido al crecimiento del tumor en la proximidad de los orificios ureterales es extremadamente rara. Este efecto permite que acompaña los períodos de crecimiento y de tratamiento más largos.
La principal limitación de la inoculación del tumor guiada por ecografía es la necesidad de un equipo técnico adecuado. Por lo tanto el rendimiento de este procedimiento es probable que se limita a los centros que se especializan en modelos animales de cáncer humano. Esto debería fomentar la colaboración entre grupos de investigación fuera de estas instituciones y de los grupos con experiencia en dicha novela modelado animal.
Aunque depende de la familiaridad con la ecografía y cierta destreza manual, este modelo es fácil de aprender bajo la instrucción competente. La etapa clave en el procedimiento es la creación de un espacio artificial por vía submucosa en la pared de la vejiga con solución salina. Una vez creado este espacio sin perforación of la capa de la mucosa, que se mantiene estable durante varios minutos. La orientación de la segunda aguja en este espacio con el fin de inocular las células tumorales es relativamente simple. La principal complicación durante la creación del espacio submucoso es la perforación de la aguja en el lumen de la vejiga. La creación de un espacio submucoso, sin embargo, sigue siendo viable. La aguja tiene que ser retirado lentamente en la pared de la vejiga y la solución salina se inyecta sólo cuando la capa de la mucosa voltea sobre la punta de la aguja. Después de esta maniobra el espacio submucoso es menos estable (solución salina se escapará al lumen de la vejiga dentro de 30-60 seg) y la inyección de las células tumorales tiene que ser realizado rápidamente. El derrame de las células tumorales en el lumen de la vejiga puede ocurrir en estos casos con perforación de la mucosa. Aunque la pérdida de las células tumorales del espacio intramuros podría conducir a una disminución del volumen del tumor durante el seguimiento, nunca hemos observado ningún captación tumoral intravesical.
Otro potencial Complication es el vertido de las células tumorales a la cavidad peritoneal a través del canal de inyección. Hemos observado un solo intraperitoneal difusión de células tumorales en 50 animales, y esto ocurrió en uno de nuestros primeros intentos. Atribuimos esto a la inyección de un volumen demasiado importante suspensión de células tumorales. Esto fue apoyado por el hecho de que la reducción del volumen de 50-40 l no dio lugar a derrame intraperitoneal más.
Esta inoculación mínimamente invasivo de murino ortotópico de xenoinjertos de cáncer de vejiga representa una modificación innovadora del "modelo intramural" existente, beneficiando tanto el investigador como los animales por igual. Las ventajas de este modelo estimulan su adaptación a otros órganos tales como el riñón, la próstata y el hígado con el fin de establecer tumores de xenoinjertos ortotópico de una manera mínimamente invasiva.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer Eliana Beraldi para llevar a cabo la transducción viral de líneas celulares tumorales y Ben Deeley para su instrucción en el uso de la pequeña plataforma de imágenes de ultrasonido animal.
Este proyecto fue apoyado por el Sistema Fundación Alemana (DFG; JA 2117/1-1: 1), el Instituto de Investigación de la Sociedad Canadiense del Cáncer y un Premio Científico Mentored Médico de Vancouver Coastal Health Research Institute. La plataforma de imágenes de ultrasonido fue financiado por la Fundación Canadiense para la Innovación.
Materials
| Chlorhexidine gluconate (2%) | Aplicare | 82-319 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3008101 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 356234 | Keep between 2-4⁰C |
| Isoflurane | Baxter Corporation | 402-069-02 | |
| Trypsin (0.25%) | Thermo Scientific | SH3004202 | |
| Syringe (1ml) | BD Bioscience | 309659 | |
| Hypodermic needle (30G; ¾ inch) | Kendall | 830340 | |
| Angiocatheter (24G) | BD Bioscience | 381112 | |
| Vevo 770 small animal imaging platform | VisualSonics | ||
| RMV 706 ultrasound scanhead | VisualSonics | ||
| IVIS Lumina III | Caliper Life Science |
Referenzen
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J. Cell. Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU Int. 100, 1377-1384 (2007).
- Kang, M. R., et al. An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Xiao, Z., et al. Characterization of a novel transplantable orthotopic rat bladder transitional cell tumour model. Br. J. Cancer. 81, 638-646 (1999).
- Iinuma, S., Bachor, R., Flotte, T., Hasan, T. Biodistribution and phototoxicity of 5-aminolevulinic acid-induced PpIX in an orthotopic rat bladder tumor model. J. Urol. 153, 802-806 (1995).
- Jäger, W., et al. Hiding in plain view: Genetic profiling reveals decades old cross-contamination of bladder cancer cell line KU7 with HeLa. J. Urol. (13), (2013).
- Horiguchi, Y., Larchian, W. A., Kaplinsky, R., Fair, W. R., Heston, W. D. Intravesical liposome-mediated interleukin-2 gene therapy in orthotopic murine bladder cancer model. Gene Ther. 7, 844-851 (2000).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Black, P. C., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106, 1799-1804 (2010).
