Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto
Summary
Qui descriviamo un saggio fenotipico applicabile agli schermi ad alta produttività /alto contenuto di RNA sintetico (siRNA), composto chimico e librerie mutanti Mycobacterium tuberculosis. Questo metodo si basa sul rilevamento di Mycobacterium tuberculosis con etichetta fluorescente all’interno di una cellula ospite etichettata fluorescentmente utilizzando la microscopia confocale automatizzata.
Abstract
Nonostante la disponibilità di terapia e vaccino, la tubercolosi (TB) rimane una delle infezioni batteriche più mortali e diffuse al mondo. Da diversi decenni, l’improvvisa esplosione di ceppi multi- ed estesamente resistenti ai farmaci è una seria minaccia per il controllo della tubercolosi. Pertanto, è essenziale identificare nuovi obiettivi e percorsi critici per l’agente causale della tubercolosi, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)e cercare nuove sostanze chimiche che potrebbero diventare farmaci per la tubercolosi. Un approccio è quello di mettere a punto metodi adatti agli schermi genetici e chimici delle biblioteche su larga scala che consentano la ricerca di un ago in un pagliaio. A tal fine, abbiamo sviluppato un saggio fenotipico basato sul rilevamento di Mtb etichettate fluorescentmente all’interno di cellule ospiti etichettate fluorescentmente utilizzando la microscopia confocale automatizzata. Questo saggio in vitro consente una quantificazione basata sull’immagine del processo di colonizzazione della Mtb nell’ospite ed è stato ottimizzato per il formato micropiatta 384-well, che è corretto per schermi di siRNA-, composto chimico- o mtb mutante-librerie. Le immagini vengono quindi elaborate per l’analisi multiparametrica, che fornisce l’inferenza di lettura sulla patogenesi della Mtb all’interno delle cellule ospiti.
Introduction
Tra gli agenti patogeni infettivi emergenti e riemergendo segnalati negli ultimi anni, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) occupa un posto di primo piano essendo responsabile di 1,4 milioni di morti e 8,7 milioni di nuove infezioni nel 2011 (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Nonostante la disponibilità di terapie multifarmaco, il numero di persone infette è ancora in aumento e la mtb multifarmaco resistente (MDR) e ampiamente resistente ai farmaci (XDR) si sta rapidamente diffondendo in tutto ilmondo 1. Inoltre, quando si prende in considerazione la presenza di antigeni mtb, è evidente che un terzo della popolazione globale è considerato latentemente infettato dalla Mtb. Statisticamente, in un caso su dieci, vi è evoluzione verso la forma attiva della malattia con successivi sintomi clinici2. Pertanto, sono urgentemente necessari nuovi mezzi per combattere la Mtb. In questo contesto, abbiamo sviluppato un saggio fenotipico visivo in vitro basato sul monitoraggio dell’invasione e della moltiplicazione delle Mtb nelle cellule ospiti mediante microscopia a fluorescenza confocale automatizzata3. L’adattamento del saggio in piastre microtiter a 384 pozzi in combinazione con l’acquisizione e l’analisi automatizzate delle immagini, ha permesso lo screening ad alto contenuto / alta produttività (HC / HTS) di librerie su scala media di composti, siRNA e mutanti batterici. Lo screening di una libreria RNAi a livello genomico su questo saggio fenotipico ha quindi permesso l’identificazione dei principali fattori ospiti coinvolti nel traffico di Mtb e nella replicazione intracellulare, ma anche la spiegazione delle vie ospiti sfruttate dal bacillo tubercolare. Un altro adattamento di questo particolare saggio fenotipico è stato per l’identificazione di fattori batterici essenziali per la persistenza intrafagosomale della Mtb. Ad esempio, l’arresto della maturazione fagoma è considerato uno dei principali meccanismi che facilita la sopravvivenza e la replicazione della Mtb nel macrofago. Il monitoraggio della localizzazione subcellulare dei mutanti knock-out mtb in compartimenti acido-etichettati fluorescentmente ha permesso l’identificazione di geni batterici coinvolti nel processo di sopravvivenza4. Infine, l’imaging ad alto contenuto di Mtb offre anche un metodo eccellente per quantificare l’efficienza del farmaco per inibire vari fenomeni come la crescita batterica intracellulare3. Complessivamente, questo tipo di saggio fenotipico ad alta produttività consente di accelerare la scoperta di farmaci contro la TBC e i dati raccolti da questi diversi approcci contribuiscono a una migliore comprensione della manipolazione dell’ospite esercitata da Mtb.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo qui i metodi necessari per un saggio fenotipico utilizzando un ceppo Mtb H37Rv che esprime GFP per infettare le cellule ospiti etichettate fluorescentmente, il che lo rende appropriato per schermi ad alto contenuto / ad alta produttività. Questo protocollo potrebbe essere applicato a una vasta gamma di composti, sonde fluorescenti e mutanti Mtb. Per ogni protocollo sopra descritto, è possibile eseguire passaggi di fissazione e immunoetichettatura prima dell’acquisizione dell’immagine. Util…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il sostegno finanziario a questo lavoro è stato fornito dalla Comunità europea (sovvenzione ERC-STG INTRACELLTB n° 260901, sovvenzione MM4TB n° 260872), dall’Agence Nationale de Recherche, dalla Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) e dalla regione Nord Pas de Calais. Riconosciamo con gratitudine l’assistenza tecnica di Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni e Frank Lafont dalla piattaforma BICeL.
Materials
| µclear-plate black, 384 well | Greiner bio-one | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384 well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white , 384 well-plate | Greiner bio-one | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| FICOLL PAQUE PLUS | DUTSCHER | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1X | Life Technologies | 15040033 | Non enzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Non targeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfert, storage and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
Referenzen
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
