免疫突触由双色时间选通受激发射损耗（STED）纳米显微可视化

1。大衣盖玻片与抗体 Prewarm（37℃）30毫升的RPMI 10％FCS培养基和1ml BD Cytofix / Cytoperm的。 制备的磷酸盐缓冲盐水（PBS）5微克/纯化的抗体的溶液中。对于激活NK92细胞系，利用反CD18和抗NKp30的推荐。 商标申请一个约角钱大小的圆圈为每个条件上使用PAP笔在＃1.5盖玻片。对于双色彩实验，应该有四个条件：未染色，双染，和两个单染条件。免除200微升的抗体溶液在每个区域中，孵育在37℃下30分钟。 在室温下轻轻地浸渍在50ml锥形管中的每个在50 1毫升的PBS洗涤盖玻片。洗涤应在加入的细胞和应小心以避免在盖玻片抗体烘干立即发生。 2。启动封面上​​的自然杀伤细胞单;修复和通透每个隔离条件5×10 5 NK92细胞。离心，倒出上清液。用10ml预热的媒体从步骤1.1洗一次。离心，倒出上清液。 重悬的细胞在从步骤1.1预热介质以2.5×10 6 / ml的浓度。 轻轻倒出200μl到1.2.1节中创建的区域的中心。在37℃下进行20分钟，在5％CO 2。 （注：这个时间可以延长或减少取决于利益的生物学功能对于NK细胞颗粒极化，20分钟就足够了。）。 下列细胞的孵育后，轻轻地通过在50ml锥形管中浸渍各50毫升室温的PBS洗涤盖玻片。 加入1μl的Triton X-100的1毫升彻底从步骤1.1和涡流预热的修复/烫发液。固定和通透加入200微升的修复/彼尔姆缓冲（步骤2.3）的细胞。孵育10米在黑暗中在室温下进行。 3。细胞染色制备染色缓冲液：磷酸盐缓冲盐水（PBS），1％BSA，0.1％皂素。 制备第一抗体的溶液中 200微升 染色缓冲液（见步骤3.1）。 （注：抗体应在使用前进行滴定）。避免使用时引发在用于涂覆的盖玻片（步骤1.2）的同种第一抗体。此外，还要避免Strepatividin-生物素的联系为STED成像。 下节2.3.1，轻轻在50毫升染色缓冲洗盖玻片。轻拍PAP笔区域的边缘用棉签去除多余的缓冲区。适用于3.1.1节创建的抗体溶液。孵育30分钟，在黑暗中在室温下进行。 （建议：在孵育箱滑动盖玻片用潮湿的纸巾以保持湿度）。 制备第二抗体溶液中 200微升 染色法缓冲区。推荐荧光团的Alexa Fluor 488，太平洋橙，和V500。一般来说，一个1:200稀释，适合STED成像。 在50毫升染色缓冲液轻轻冲洗盖玻片。轻拍PAP笔区域的边缘用棉签去除多余的缓冲区。适用于二次抗体溶液。孵育30分钟，在黑暗中在室温下进行。 重复洗涤和染色的其他蛋白。如果检测到的F-肌动蛋白的鬼笔环肽用，这可以包括与二次抗体，一般在1:200稀释。 4。摩盖玻片上的幻灯片准备安装介质。注：时延或延长黄金是可取的。 VECTASHIELD必须避免，因为它不是用受激发射损耗兼容。必须避免2,2 – thiodioethanol如鬼笔环肽被使用。 MOWIOL是可以接受的。 将约10-20微升幻灯片上的安装介质。反转盖玻片（细胞面朝下），并安装盖玻片轻轻地，小心地避免引入气泡。幻灯片孵育24小时（盖玻片上）前成像。 密封盖玻片的边缘用指甲油。 5。实验装置启动所需的激光器和软件。启动STED枯竭激光以100％功率。对齐STED激光，这在商业系统的情况下通常是一个自动化的过程。 重点样本，单染控制开始，使用目镜显微镜。 6。设置的优化扫描第一信道和优化激光功率，激发光束位置和检测器的范围。如果可能的话，避免> 100的增益。捕获图像中的共聚焦到优化设置。线和/或帧平均会提高分辨率。检查像素的饱和度。注意：某些饱和度是在共聚焦接受的应用受激发射损耗将减少排放的强度。对于受激发射损耗，最佳的像素尺寸将是30nm以下如何以往更好的分辨率将与更小的像素尺寸来获得。被成像的感兴趣区域的大小将决定像素大小的下限。更小的像素尺寸可能会增加漂白。 应用STED光束枯竭和捕捉图像，从50％枯竭激光功率。如果在分辨率的改善可以看到的，更耗尽激光功率可被应用。在此阶段，可能有必要调整激发激光功率，平均线，和/或增益。 申请时间选通，以降低背景（最低0.3纳秒）。调整设置，直到过共聚焦分辨率的提高可以看出。分辨率可以通过估计半峰全宽（FWHM）来近似。这代表在通过在感兴趣的结构画线配置文件中创建一个高斯峰的半最大强度的距离，估计是分辨率的一种广泛使用的方法。 一旦第一个通道是令人满意的，启动第二序列为SEquential扫描。在一般情况下，最好是扫描较长波长的荧光团第一。在第二个通道重复步骤6.1。 由成像单染控制与两个扫描序列确认缺乏光谱重叠的。温和的光谱重叠可以使用软件中的频谱未混合的特点予以纠正，但应尽可能避免。 7。图像采集获取图像。对于定量成像，建议以得到至少20张/条件。确切的数字，但是，应根据实验的问题在演唱会与统计方法，如样本量的计算定义。保存实验。 8。解卷积用反卷积软件或批量处理器打开文件。检查参数使用软件每个通道。确认每个通道的激发和发射光谱，受激发射损耗消耗排放，成像方向化（上升或下降，如果该图像是3维）尤其如此。 使用去卷积反卷积向导。默认设置是通常足够，但是信噪比（SNTR）会有所不同荧光团的荧光团，以及将需要对每个通道和每个单独的实验来确定。