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Immunologie und Infektion

Visualizzazione della immunologica Synapse da Dual Color Time-gated emissione stimolata Depletion (STED) Nanoscopia

Published: March 24, 2014
doi:
10.3791/51100
,
1Center for Human Immunobiology,Texas Children’s Hospital and Baylor College of Medicine

Summary

Qui illustriamo il protocollo per l'imaging a due colori STED nanoscopia il citotossica sinapsi immunitaria delle cellule NK ricapitolato su vetro. Usando questo metodo si ottiene nm risoluzione sub-100 di proteine ​​sinaptiche e il citoscheletro.

Abstract

Cellule killer naturali formano strettamente regolamentati, le sinapsi immunologica finemente sintonizzato (IS), al fine di lisare cellule infettate da virus o tumorali. Actina riorganizzazione dinamica è fondamentale per la funzione delle cellule NK e la formazione della IS. Imaging di F-actina alla sinapsi ha tradizionalmente utilizzato microscopia confocale, tuttavia il limite di diffrazione della luce limita risoluzione di microscopia a fluorescenza, compresi confocale, a circa 200 nm. I recenti progressi nella tecnologia di imaging hanno permesso lo sviluppo di subdiffraction limitata super-risoluzione di immagini. Per visualizzare all'architettura F-actina presso la IS si Ricapitoliamo il citotossica delle cellule NK sinapsi aderendo cellule NK di attivare il recettore su vetro. Abbiamo poi le proteine ​​di immagini di interesse utilizzando due colori esaurimento emissione stimolata di microscopia (STED). Ciò si traduce in <80 nm risoluzione alla sinapsi. Qui descriviamo le fasi di preparazione del campione e l'acquisizione di immagini utilizzando dual colo STED nanoscopia per visualizzarne la F-actina al NK IS. Abbiamo anche illustrare l'ottimizzazione dell'acquisizione campione utilizzando software SP8 Leica e time-gated STED. Infine, utilizziamo software Huygens per la post-elaborazione deconvoluzione delle immagini.

Introduction

La sinapsi immunologica è un complesso ambiente di proteine ​​di segnalazione ed elementi del citoscheletro. La sinapsi citolitica è stato originariamente descritto come un "occhio di bue" come la struttura con un anello di actina e di adesione delle molecole che circondano un dominio centrale secretoria 1-4. Tuttavia, ora sappiamo che essa consiste di domini microscopici di segnalazione attivo che richiedono continua riorganizzazione del citoscheletro dinamico per la funzione 5-11. Molte delle informazioni che ora abbiamo circa la sinapsi è stata derivata da microscopio, e immunologi sono stati i primi ad adottare la tecnologia di imaging all'avanguardia.

Una di queste tecnologie romanzo è super-risoluzione microscopia. Microscopia ottica convenzionale è spazialmente limitata dalla barriera di diffrazione della luce, che definisce il limite inferiore di risoluzione per tutti microscopia a fluorescenza, compresi confocale, a circa 200 nm. Negli ultimi anni, diverse tecniche sono state developed che permettono la risoluzione di sotto della barriera di diffrazione. Questi includono la stimolazione delle emissioni esaurimento microscopia (STED), microscopia illuminazione strutturata (SIM), microscopia stocasticamente risolti (STORM) e microscopia ottica fotoattivabile (PALM). Queste tecniche sono stati esaminati in dettaglio altrove 12-15, ma sono riportate qui di seguito. Subdiffraction limitata risoluzione è generato in modo unico in ciascun sistema. La selezione di una tecnica di super-risoluzione, dunque, deve essere dettata dall'esperimento e sistema sperimentale di interesse.

STED super-risoluzione si ottiene mediante una ad alta intensità toroidale del fascio di esaurimento che selettivamente "silenzi" di fluorescenza intorno ad ogni fluoroforo di interesse a seguito di eccitazione, con conseguente subdiffraction limitata microscopia a fluorescenza 16-18. Un vantaggio di STED è che l'acquisizione delle immagini è rapida e richiede relativamente piccolo post-elaborazione. Mentre la selezione colorante è dettata dalle specifichetrale posizione del fascio di esaurimento, che nel sistema disponibile in commercio è situato a 592 nm, vari coloranti disponibili in commercio sono disponibili che rendono combinazioni di due fluorofori possibile. Inoltre, i giornalisti fluorescenti comunemente usati come GFP può essere ripreso, facendo esperimenti cellule vive possibili 19,20.

Abbiamo precedentemente utilizzato STED per identificare e quantificare le regioni di ipodensità F-actina che vengono utilizzati dalle cellule NK per degranulazione 21,22. Proponiamo che STED è una buona scelta per l'imaging sinapsi immunitario grazie alla sua disponibilità relativamente flessibile di fluorofori e il miglioramento superiore nella risoluzione nell'asse xy. Inoltre, il sistema STED disponibile in commercio utilizzato per questi esperimenti, l'uso di una alta velocità (12.000 Hz) scanner risonanza consente una rapida acquisizione di immagini con minimo danno ai campioni. Limitata flessibilità nella selezione colorante è considerato uno svantaggio di STED 12,tuttavia due colori STED è relativamente semplice con diversi fluorofori disponibili in commercio. L'integrazione di STED con un microscopio confocale a scansione laser permette inoltre di ulteriori confocale in combinazione con STED, così mentre STED è limitata a due canali, strutture supplementari possono essere esposte in confocale con risoluzione di circa 200 nm (E. Mace, osservazioni non pubblicate ). Mentre si descrive l'uso di STED per l'imaging cellule immunitarie, questa tecnologia viene applicata ad una varietà di tipi cellulari, comprese le cellule neurali, e per la visualizzazione di una varietà di strutture cellulari 23-26.

SIM utilizza un approccio diverso per generare immagini subdiffraction limitata. Visualizzando noti schemi di eccitazione periodica, le informazioni possono essere ottenute sulla struttura sconosciuta essere studiati seguente trasformazione matematica 27. Questo produce un aumento della risoluzione a ~ 100 nm lateralmente 28,29. Il vantaggio di SIM è che is compatibile con tutti i coloranti confocali standard e sonde, ma lo svantaggio è che è molto più lento di acquisire immagini e questi richiedono lunga post-elaborazione 12. Ciò limita anche il suo utilizzo per l'imaging cellulare dal vivo.

Infine, immagini super-risoluzione possono essere generati da stocastico foto-commutazione di fluorofori. Questo approccio viene sfruttata in foto-attivato la localizzazione di microscopia (PALM) e stocastico di microscopia ottica ricostruzione (STORM). Con la scansione di più fotogrammi della telecamera e localizzare molecole attivate in modo casuale che sono attivati ​​"a" e "off" nel corso del tempo, le immagini con risoluzione di 20-30 nm sono generati da fotogrammi accumulati 30-32. Il trade-off di questa risoluzione è il tempo richiesto per acquisire immagini.

Qui vi mostriamo, in dettaglio, il protocollo per la preparazione e l'imaging di campioni a due colori in STED. In questo sistema, è eccitazione con un pulsata, sintonizzabile, laser a luce bianca. A causa della naturadel fascio di eccitazione a impulsi, tempo di controllo di rilevamento è resa possibile e risoluzione ulteriori aumenti. Inoltre, il sistema è dotato di gadolinio ibrido (HYD) rivelatori, che sono più sensibili di tubi fotomoltiplicatori tradizionali, consentendo così bassi requisiti di potenza laser. Il fascio esaurimento per STED viene applicato continuamente ed è sintonizzato a 592 nm, che detterà la scelta di coloranti disponibili per due colori STED. Combinazioni di colorante comunemente usati generalmente includono una eccitabili da 488 nm (come Alexa Fluor 488, Oregon Verde, DyLights verdi, o Chromeo 488) e uno eccitabile da 458 nm (ad esempio Pacific Arancio o Horizon V500). Così, mentre il rilevamento dei due coloranti sarà in un range simile (ed entrambi sono accessibili dal laser esaurimento), eccitazione si verifica con diverse lunghezze d'onda. Con rilevatori laser luce e accordabili bianchi accordabili, segnale di massimizzare eliminando sovrapposizione spettrale è reso abbastanza facile. Come tale, abbiamo avuto un buon successo con combinationi di coloranti disponibili in commercio, come Pacific Orange e Alexa Fluor 488 (usato qui). Il nostro protocollo è orientato verso e descrive la valutazione di cellule NK umane che rappresenta il fulcro storico del nostro laboratorio. Stiamo in particolare utilizzando la linea cellulare NK92 in questo esempio come quello è quello che abbiamo regolarmente applicate nel nostro lavoro sperimentale 21,33.

Protocol

1. Coprivetrini cappotto con anticorpi Preriscaldare (a 37 ° C) 30 ml di RPMI 10% FCS e supporto 1 ml di BD Cytofix / Cytoperm. Preparare una soluzione di 5 pg / ml di anticorpo purificato in tampone fosfato (PBS). Per l'attivazione della linea cellulare NK92, uso di anti-CD18 e anti-NKp30 è raccomandato. Mark cerchio di dimensioni di circa un centesimo per ogni condizione su un # 1.5 vetrino con una penna PAP. Per un esperimento di due colori, non ci dovrebbero essere quattro condizioni: senza macchia, doppio macchiati, e due condizioni colorate singoli. Pipettare 200 ml di soluzione di anticorpi in ogni regione e incubare a 37 ° C per 30 min. Lavare coprioggetto immergendo delicatamente ciascuno in 50 ml di PBS in una provetta conica da 50 ml a temperatura ambiente. Lavaggio deve avvenire immediatamente prima l'aggiunta di cellule e cura devono essere prese per evitare di anticorpi essiccazione sul vetrino. 2. Attivare le cellule NK di coperturascivola, Fix e permeabilize Isolare 5 x 10 5 NK92 cellule per condizione. Centrifuga e decantare il surnatante. Lavare una volta con 10 ml di media preriscaldata dal punto 1.1. Centrifuga e decantare il surnatante. Risospendere le cellule in mezzi preriscaldate dal punto 1.1 a una concentrazione di 2,5 x 10 6 / ml. Decantare lentamente 200 ml al centro della regione creata al punto 1.2.1. Incubare a 37 ° C per 20 min a 5% di CO 2. (Nota: questo tempo può essere prolungato o ridotto a seconda della funzione biologica di interesse per NK granello cella di polarizzazione, 20 min è sufficiente.). Dopo l'incubazione delle cellule, lavi delicatamente coprioggetto immergendo ciascuna in 50 ml di PBS a temperatura ambiente in una provetta da 50 ml. Aggiungere 1 l di Triton X-100 a 1 ml di soluzione preriscaldata Fix / Perm dal punto 1.1 e vortice accuratamente. Fix e permeabilize aggiungendo 200 ml di tampone Fix / Perm (fase 2.3) alle cellule. Incubare per 10 min al buio a temperatura ambiente. 3. Celle Stain Preparare colorazione buffer: tampone fosfato (PBS), 1% BSA, 0,1% saponina. Preparare la soluzione di anticorpo primario in 200 ml buffer di colorazione (vedi punto 3.1). (Nota: l'anticorpo deve essere titolata prima dell'uso). Evitare l'uso di anticorpo primario che viene generato nella stessa specie utilizzate per rivestire il vetrino (punto 1.2). Anche evitare collegamenti Strepatividin-biotina per l'imaging STED. Dopo sezione 2.3.1, lavare delicatamente vetrini in 50 ml di colorazione buffer. Tamponare bordi della PAP-pen regione con un batuffolo di cotone per rimuovere il tampone in eccesso. Applicare la soluzione di anticorpo creato nella sezione 3.1.1. Incubare 30 minuti al buio a temperatura ambiente. (Consigliato: incubare vetrini in casella diapositiva con un tovagliolo di carta umido per mantenere l'umidità). Preparare la soluzione di anticorpo secondario 200 ml Colorazionebuffer. Fluorofori consigliate sono Alexa Fluor 488, Pacific Orange, e V500. Generalmente, una diluizione 1:200 è adatto per l'imaging STED. Lavare delicatamente vetrini in 50 ml di colorazione buffer. Tamponare bordi della PAP-pen regione con un batuffolo di cotone per rimuovere il tampone in eccesso. Applicare la soluzione anticorpo secondario. Incubare 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Ripetere il lavaggio e colorazione per le proteine ​​di interesse aggiuntivi. Se rilevando F-actina con falloidina, questo può essere inclusa con anticorpo secondario, generalmente ad una diluizione 1:200. 4. Mount Coprivetrini su diapositive Preparare mezzo di montaggio. Nota: Prolungare o prolungare oro sono preferibili. Vectashield deve essere evitata, in quanto non è compatibile con STED. 2,2-thiodioethanol deve essere evitata se si utilizza falloidina. Mowiol è accettabile. Mettere a circa 10-20 ml di mezzo di montaggio in una diapositiva. Inverti coprioggetto (cellulare rivolto verso il basso) e montare coprioggetto delicatamente, avendo cura dievitare l'introduzione di bolle d'aria. Incubare i vetrini per 24 ore (fino coprioggetto) prima di imaging. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto. 5. Setup sperimentale Avviare laser e software necessari. Avviare STED laser esaurimento al 100% di potenza. Allineare STED laser, che nel caso di sistemi commerciali è spesso una procedura automatizzata. Mettere a fuoco il campione, a cominciare con il controllo macchiato singolo, il microscopio usando oculari. 6. Ottimizzazione delle impostazioni Eseguire la scansione del primo canale e ottimizzare la potenza del laser, la posizione del fascio di eccitazione e la gamma del rivelatore. Se possibile, evitare un guadagno di> 100. Catturare l'immagine confocale per ottimizzare le impostazioni. Line e / o telaio media aumenterà risoluzione. Verificare la saturazione dei pixel. Nota: Alcuni saturazione è accettabile in confocale come applicazione di STED ridurrà l'intensità di emissione. Per STED, una dimensione ottimale dei pixel sarà inferiore a 30 nm comesempre migliore risoluzione viene ottenuta con dimensioni di pixel più piccole. La dimensione della regione di interesse viene esposta detterà il limite inferiore della dimensione dei pixel. Dimensioni dei pixel più piccoli possono aumentare photobleaching. Applicare un'immagine di acquisizione STED fascio esaurimento e, iniziando con il 50% della potenza del laser esaurimento. Se un miglioramento della risoluzione è visto, più potenza laser esaurimento può essere applicata. In questa fase, può essere necessario regolare la potenza di eccitazione laser, media linea, e / o il guadagno. Applicare tempo di controllo per ridurre sfondo (minimo 0,3 NSEC). Regolare le impostazioni finché un miglioramento della risoluzione rispetto confocale può essere visto. La risoluzione può essere approssimata stimando larghezza metà del massimo (FWHM). Essa rappresenta la distanza alla metà dell'intensità massima di un picco gaussiano creato tracciando una linea di profilo attraverso la struttura di interesse, ed è un metodo ampiamente utilizzato per stimare risoluzione. Una volta che il primo canale è soddisfacente, avviare una seconda sequenza per sésequenziali scansione. In generale, è meglio effettuare la scansione della lunghezza d'onda più lunga fluoroforo prima. Ripetere passo 6.1 su secondo canale. Conferma la mancanza di sovrapposizione spettrale per l'imaging controlli colorate singoli con entrambe le sequenze di scansione. Sovrapposizione spettrale lieve può essere corretto utilizzare le funzioni delle Nazioni Unite mescolando spettrali nel software, invece, va evitato, ove possibile. 7. Acquisizione Immagine Acquisire immagini. Per l'imaging quantitativo, si consiglia di ottenere almeno 20 immagini / condizione. Il numero esatto, tuttavia, dovrebbe essere definito secondo la domanda sperimentale in concerto con un approccio statistico come calcolo della dimensione campionaria. Salvare esperimento. 8. Deconvoluzione Apri il file con il software di deconvoluzione o il processore batch. Controllare i parametri per ciascun canale utilizzando il software. Conferma di eccitazione e di emissione spettri di ciascun canale, STED emissione di esaurimento, e di imaging direzionezione (su o giù, se l'immagine è 3-dimensionale) in particolare. Deconvolve utilizzando la procedura guidata deconvoluzione. Le impostazioni predefinite sono generalmente adeguate, tuttavia il segnale di rumore (SnTR) varierà da fluoroforo a fluoroforo e dovrà essere determinato per ogni canale e ogni esperimento singolarmente.

Representative Results

Chiaramente, un obiettivo primario di super-risoluzione di immagini sarà un miglioramento rispetto microscopia confocale convenzionale. Tuttavia, ci sono alcuni problemi comuni che possono portare a una risoluzione ottimale. Questi richiedono che ogni esperimento essere ottimizzato individualmente. Nel nostro esperimento rappresentativo, stiamo IMAGING la rete F-actina in cellule NK attivate da anticorpo legato al vetro. Le cause comuni di (e correzioni per l') mancanza di migliore risoluzione di STED confocale sopra sono i seguenti: Sotto-campionamento (Figura 1a). Ciò può condurre a granulosità e la perdita di informazioni dei pixel, come mostrato dalla scarsa risoluzione di filamenti di F-actina. Aumento della linea o telaio media spesso può correggere questo. Candeggio e / o sovra-campionamento (Figura 1b). Ciò può essere causato da lungo tempo di sosta pixel come un risultato di un eccessivo linea media. In alternativa, può essere un risultato di un eccesso di scansione dell'immagine prima dell'acquisizione, compreso uso eccessivo diil laser esaurimento. Questo comunemente si traduce in immagini confuse o sfocate. Questo può essere corretto scansione del campo di interesse solo minimamente prima di acquisire o, se possibile, aumentando la velocità di scansione laser. Se il problema persiste, la potenza del laser esaurimento può essere ridotto. Con il raggiungimento del giusto equilibrio di tempo pixel sosta, potenza del laser di eccitazione, e la potenza del laser esaurimento, un'immagine con una migliore risoluzione e informazioni sufficienti può essere generato (Figura 1c). La risoluzione può essere ulteriormente migliorata con l'uso di deconvoluzione (Figura 1d). Quando l'acquisizione è ottimizzato, deconvoluzione migliorerà la risoluzione sia qualitativamente che quantitativamente e sub-100 nm risoluzione dovrebbe essere di routine raggiungibile. Figura 1. Ottimizzazione di acquisizione e trabocchetti comuni di immagini STED. NK92 cellule sono state attivate su vetro rivestito anti-CD18 e-NKp30 per 20 minuti, allora fisso, permeabilizzate e colorate per la F-actina con falloidina Alexa Fluor 488.) L'esempio di perdita di informazioni dell'immagine a causa di sotto-campionamento. b) Un esempio di perdita di risoluzione a causa di sbiancamento / over-sampling c) le condizioni d ottimizzato) condizioni ottimizzate portano ad un miglioramento maggiore risoluzione deconvoluzione. Barra della scala = 5 micron.

Discussion

Il miglioramento della risoluzione rispetto confocale sarà piuttosto dipendente da fattori non controllabili. Questi fattori includono aberrazioni minori nella copertura dello spessore di slittamento e di incongruenze nel mezzo di montaggio. È importante mantenere la temperatura e l'umidità nella camera di imaging più coerente possibile, e il fascio STED opportuno allinearla approssimativamente ogni 60 min. Come accennato in procedure, l'uso di mezzo di montaggio Vectashield deve essere evitata, in quanto questo non è compatibile con STED. Inoltre che, si dovrebbe sempre utilizzare al # 1.5 vetrini e, se disponibile, utilizzare quelli che sono stati verificati ad uno spessore specifico.

Una modifica del metodo qui descritto è di immagine canali supplementari confocale, utilizzando fluorofori che emettono alla lunghezza d'onda più lunga del fascio STED. In questo modo, un'immagine può fino a quattro canali (due in confocale, due in STED). Se questo approccio, tuttavia, i canali con fluorofori equella sede sopra il laser esaurimento STED dovrà essere ripreso prima, come applicazione del fascio STED esaurirà fotoni in questi canali. Un vantaggio di questa tecnica è l'applicazione del tempo di controllo, che sarà anche migliorare la risoluzione in confocale eliminando emissione da fotoni con brevi vite 34. In particolare, l'uso di gating tempo, i tempi di rivelatori di emissione per corrispondere con eccitazione impulsiva STED, diminuirà la fluorescenza di riflessione fuori dal vetro coprioggetto quando l'imaging vicino ad esso. Anche in un esperimento non adatto per STED, se si utilizza una sorgente di eccitazione a impulsi, tempo di controllo può essere uno strumento utile per migliorare la risoluzione in confocale.

Ci sono varie modifiche che possono essere utilizzati per migliorare la risoluzione in STED. Uno è quello di ridurre le dimensioni del foro da 1 unità Airy standard, anche se questo sarà anche diminuire la quantità di luce che raggiunge il campione. Questo può essere compensata aumentando Laser potere o di guadagno. Un altro è quello di aumentare la media di linea, che consentirà di aumentare la quantità di informazioni raccolte per ogni fotone, migliorando la risoluzione. Ancora una volta, tuttavia, puo essere a costo di photobleaching del campione, così un saldo dovrà essere colpito tra risoluzione e sbianca. Analogamente, l'uso di proteine ​​fluorescenti come la GFP richiederà un'attenta ottimizzazione per evitare sbianca. Ciò può essere ottenuto riducendo la potenza del laser STED se necessario. Punti di tempo più lunghi anche maggiore recupero di fotoni e ridurre lo sbiancamento. Correzione per fotodecolorazione deve essere contabilizzata quando si analizza dal vivo STED.

Naturalmente, l'imaging in 3 dimensioni in STED è anche possibile, e darà anche un miglioramento rispetto confocale convenzionale. Questo è particolarmente vero se è fatto in combinazione con deconvoluzione, anche se occorre prestare attenzione per correggere la deriva che si verifica durante l'imaging piani multipli in z. Se si utilizza il software Huygensa deconvolve, questa correzione si ottiene utilizzando la funzione "stabilizzare l'immagine". Usando questo approccio, la risoluzione in z sarà migliorata. Questo è un grande miglioramento rispetto confocale convenzionale, che ha scarsa risoluzione assiale, e anche su sé solo STED, che ha anche relativamente scarsa risoluzione asse z. Mentre l'acquisizione di più gruppi in STED, la cura deve essere presa per evitare lo sbiancamento del campione, e se necessario, può ridurre la linea di media o laser intensità potere per farlo. Anche in questo caso, occorre notare che se l'imaging altri fluorofori che non sono adatti per STED, l'applicazione del fascio esaurimento nella prima scansione sequenziale impedirebbe emissione di questi canali. Pertanto, un approccio STED / confocale misto (quando si utilizza la scansione confocale in canali che emettono ad una lunghezza d'onda superiore a 592 nm), purtroppo, non essere adatto per il 3D.

Per riassumere, abbiamo scelto STED come un approccio a causa della sua relativa facilità di applicazioneblicazione e il miglioramento della risoluzione rispetto confocale standard. Per l'imaging sinapsi immune, si è dimostrato una tecnica efficace e prezioso che ci permette di vedere i dettagli in architettura non è possibile F-actina ad una risoluzione di oltre 200 nm. Mentre molti di questi dettagli sembrano sottili, possono avere un profondo effetto sulla funzione delle cellule NK. Quindi, stiamo applicando le più moderne tecnologie di imaging nanoscopica per derivare informazioni che è fondamentale per mantenere la salute umana.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Geoff Daniels per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dalla R01 AI067946 a JSO

Materials

#1.5 cover slips VWR 48393-172
BD Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554722
Bovine serum albumin Sigma A2153
Cotton tipped applicator Fisher Scientific S450941
Falcon centrifuge tubes (50 ml) VWR 352070
Fetal calf serum (FCS) (500 mL) Atlantic Biologicals S11050
Goat anti-rabbit Pacific Orange Life Technologies P31584
Laboratory tissue wipers VWR 82003-820
Nail polish VWR 100491-940
NK-92 cells ATCC CRL-2407
Phalloidin Alexa Fluor 488 Life Technologies A12379
Phosphate buffered saline Life Technologies 14190250
Prolong anti-fade reagent Life Technologies P7481
Purified anti-CD18 Biolegend 301202
Purified anti-NKp30 Biolegend 325202
Purified anti-perforin Biolegend 308102
RPMI 1640 medium (500 mL) Life Technologies 11875-093
Saponin from Quillaja bark Sigma S4521
Super PAP pen Life Technologies 008899
Triton X-100 Electron Microscopy Sciences 22142
Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
Huygens deconvolution software SVI Contact company
Leica SP8 TCS STED microscope Leica Microsystems Contact company
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Referenzen

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Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy. J. Vis. Exp. (85), e51100, doi:10.3791/51100 (2014).
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