Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi
Summary
Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.
Abstract
Bitkiler algı ayrıntılı nedeniyle değişen ortamlara ve sinyalizasyon sistemi ile hızlı bir şekilde adapte. Patojen atak sırasında Bitkiler, hızla immün komplekslerin toplama ve etkinleştirme ile enfeksiyona yanıt. Immün komplekslerinin aktivasyonu, fosforilasyon, glikosilasyon ya da ubikitinasyon gibi proteinlerin translasyon sonrası modifikasyonlar (PTMS) ile ilişkilidir. Bu PTMS koreografisini nasıl anlamak direnç elde edilir nasıl daha iyi bir anlayışa yol açacaktır.
Burada nükleotid-bağlayıcı lösin açısından zengin tekrar (LRR-NB) etkileşen proteinleri ve post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) sonraki belirlenmesi için bir protein saflaştırma yöntemi tarif etmektedir. Küçük değişikliklerle, protokol diğer bitki protein komplekslerinin saflaştırılması için uygulanabilir. Yöntem, daha sonra kısmen saflaştırılır ilgilenilen proteinin, b bir epitop etiketli versiyonu ekspresyonuna dayanıry immüno ve etkileşen protein ve PTMS belirlenmesi için kütle spek-trometresine tabi.
Bu protokol olduğunu göstermektedir: i.) Fosforilasyon gibi PTMS dinamik değişikliği kütle spektrometresi ile tespit edilebilir, ii). Bu ilgilenilen proteinin yeterli miktarda olması ve bu immünoçökeltme saflık eksikliği telafi edebilir önemlidir, iii). Ilgi konusu bir proteinin PTMS tespit etmek için, bu protein, protein yeterli bir miktarını elde etmek için imüno zorundadır.
Introduction
Bağışıklık yollar hızla sinyalleri iletmektedir ve bağışıklık tepkileri 1 aktif hale getirmek için protein çeşitli post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) dayanmaktadır. PTMS protein yapısını, etkinlik, stabilite, yerelleştirme ve protein-protein etkileşimlerini 2-4 etkileyebilir protein yapısının hızlı, tersine çevrilebilir, ve son derece spesifik kimyasal değişiklikler bulunmaktadır. Bitkilerde, PTMS 300'den fazla türleri ubikitinasyon, sumoilasyon, sülfasyon, glikosilasyon ve fosforilasyon 2,5 dahil olmak üzere tespit edilmiştir. Kanıt artan vücut bitki bağışıklık 1,5,6 farklı yönleriyle PTMS önemini vurgulamaktadır. Protein fosforilasyonu, bir serin bir fosfat grubunun tersine çevrilebilir bağlanma, treonin ya da tirosin Tortu, pek çok hücresel bir fonksiyon düzenleyici olup, şaşırtıcı bir şekilde çok yüksek cascades 5-11 sinyal bitki savunma PTM incelenmiştir. Fosforilasyon-bağımlı sinyal bitki defe ayrılmaz bir parçasıdırnse aktivasyon multidomain dayanıklılık proteinleri 5,8 ile transmembran reseptörleri tarafından mikropların hücre dışı algı, ya da hücre içi tanıma sonra başlattı.
Bitkiler işgal üzerine, mikroplar örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) 12 denilen plazma zarı reseptörleri tarafından tespit edilir. Bilinen PRR reseptör-benzeri proteinler (RLPs) ya da reseptör-benzeri kinazlar (RLKs), her ikisi de bir ligand bağlayıcı ektoalan taşıyan ve tek-geçişli bir zar geçiş alanı ya da bulunmaktadır. RLPs aksine, RLKs bir hücre içi kinaz etki alanını 13-15 sahiptir. PRRS of ekto RLKs durumunda, hücre içi etki alanı 6, 16 içinde otofosforilasyon ve transfosforilasyonu için, patojenle ilişkili moleküler modelleri (PAMPs) olarak adlandırılan lider korunmuş mikrop elisitör moleküllere bağlanır. PRRS algılama indüklediği fosforilasyon bölgesinin aşağısında, 17 kinazlar da dahil olmak üzere, sitoplazmik proteinler daha sonra fosforilasyon, </su> 18 p, 19, E3 ligaz, mitojen tarafından aktive edilen protein kinazları (MAPK 'ler) 20, 21, kalsiyum-bağımlı protein kinaz (CDPK) PAMP tetiklenen bağışıklık (PTI) 22, 23 ve 24, transkripsiyon faktörleri, 25 yol açar.
PRRS ile hücre dışı algı ek olarak, patojenlerin hücre içi sitoplazmik tanıma reseptörleri yoluyla elde edilir. Bu multidomain direnci (R) proteinlerinin değişken bir N-ucu alanı, merkezi bir nükleotid-bağlayıcı (NB) motifi, ve C-terminali lösin açısından zengin tekrarları (LRR) içerir ve bu nedenle NB-LRR proteinler 26, 27 olarak adlandırılır. R proteinleri, doğrudan veya dolaylı olarak da PRRS ve bağışıklık sisteminin diğer hedef düğümleri için bilinen efektörleri olarak adlandırılan bir patojen kaynaklı hastalık oluşturma molekülleri, tanır. Tanıma efektör-tetiklenen bağışıklık (ETI) 28-31 önde gelen güçlü savunma uyarmaktadır. NB-LRR proteinler müsadere varte NB alanı 30, 32 içindeki motif ATP-bağlama, ancak bunlar bir kinaz sahası yoksundur. NB-LRRS korunmuş etki fosforilasyonu, büyük çaplı bir proteomik diğer 33'te rapor edilmiştir, ancak ETE ile ilişkisi açık değildir. Benzer şekilde PTI için, NB-LRR proteinlerin aktivasyonu MAPK 34-37 ve 38-40 gibi CDPKs sitoplazmik proteinlerin fosforilasyonuna yol açar. En önemlisi, efektör tanıma NB-LRR protein 41 ile doğrudan etkileşim aksesuar proteinlerin fosforilasyonunun yol açabilir. Bazı örnekler NB-LRR proteinleri ile etkileşen proteinleri RIN4 (Arabidopsis thaliana) ve Pto (domates, Solanum lycopersicum) arasında, RPM1 42, 43 ve 44, sırasıyla Prf. Pseudomonas syringae bakterilerin enfeksiyon esnasında, efektör protein AvrB, reseptör-benzeri kinaz RIPK 45, büyük olasılıkla, RIN4 fosforilasyonunu uyarır <sup> 46. Benzer şekilde, domates P. syringae ve AvrPto AvrPtoB Pto 47 fosforilasyonunun uyarılması efektörler. , Bir kinaz sahasına sahip değildir ve trans-fosforile edilmiş olmalı RIN4 aksine, Pto oto-fosforilasyonu 48 ve alt tabakalar 49, 50 trans-fosforilasyonu sahip aktif bir kinazdır. Pto sinyallemesinin efektör bağımlı başlatılması için, bunun kinaz aktivitesini gerektirir, kinaz ölü Pto mutantlar yine bir efektör-bağımsız bir şekilde 51 in sinyal edebiliyoruz. Biz son zamanlarda Prf / Pto karmaşık çoklu Prf içeren, oligomerik ve Pto 52 molekülleri ve aynı kompleks içinde Pto molekülleri 47 birbirine trans-fosforilatlayabilen o göstererek bu gözlemleri açıkladı. Biz, Pto (sensör) bir molekül da ikinci Pto molekül (yardımcı) wit aktive olduğu NB-LRR protein (Prf) bir değişikliğe yol açan konformasyon, efektör protein ile etkileşime girdiği bir model önerilenkarmaşık hin. Daha sonra, yardımcı Pto molekülü sensör Pto karmaşık direnci 47 tam aktivasyonuna yol trans-fosforile eder.
Bu örnekler efektör tanınması üzerine immün kompleks bileşenleri ve potansiyel PTMS belirleme sinyalleri aşağı hedeflerine efektör algı transdüksiyona nasıl daha iyi anlaşılmasına yol açabilir göstermektedir. Burada NB-LRR etkileşen proteinler ve bunların PTMS daha sonra tespit edilebilmesi için bir protein saflaştırma yöntemi tarif etmektedir. Bir model olarak Nicotiana benthamiana ve domates Prf / Pto kompleksi kullanarak, ancak aynı protokolü kolay N. ikinci RLKs uygulanabilir benthamiana ve A. küçük değişikliklerle thalianadan 53 biz protokolü dahilinde açıklamak gibi.
Protocol
Representative Results
Discussion
PAMPs ve efektörler tarafından reseptör aktivasyonunun mekanizmasını açıklamaya bitki bağışıklığının anlayışımıza büyük katkıda bulunabilir. Son 20 yıl içinde, genetik ve maya iki hibrit ekranlar PRRS ve NB-LRR proteinlerin keşfi için vesile olmuştur. Daha yakın zamanda, kütle spektrometresi tabanlı protokoller 55-58 işaret bağışıklık kendi PTMS 11,33,59,60 boyunca ayrı düzenlenmiş proteinlerin tanımlanması için kurulmuştur, immün komplekslerin 61 ve effektör bileşim 62 hedefliyor. Burada immün komplekslerinin aktivasyonu düzenleyen PTMS belirlenmesi için basit bir protokol açıklar.
Daha önce tarif edilen protokol ile karşılaştırıldığında, bu protokol PTMS dinamik değişimlerin ayrıntılı belirlenmesini sağlar. Büyük ölçekli proteomiks yaklaşımların Protokolleri proteinlerin PTMS belirlemek ama sınırlamak nedeniyle PTMS site plastisite ortaya çıkarmak mümkün değildir olabilired protein miktarları. Protein fosforilasyon durumunda, büyük ölçekli proteomik yaklaşımlar tipik olarak sadece baskın fosforilasyon siteleri 11,33,59 belirlemek. Bir protein fosforilasyon durumunun detaylı karakterizasyonu sadece hedef proteinin 47 kısmi saflaştırılması yoluyla elde edilebilir protein bir miktar gerektirir. Protokol, saflaştırılmış proteinin kütle spektrometresi analizi ile, çiftler burada hedef proteinin önemli bir miktar veren bir protein saflaştırma bir yaklaşım tarif. Bu protokol ardından, Pto tek fosforilasyon olay, daha önceden açıklandığı gibi 52 Ser-198 ağırlıklı olarak atfedilen ancak bazı kütle spektrometresi spektrumları da Pr-195 veya Pr-199 üzerinde tek bir fosforilasyon olayı desteklenmiştir. Pto çift fosforlama etkinlik gözlenmiştir zaman başka sitelerde kombinasyonları da gözlenmiştir, ancak, fosforilli amino asitler baskın kombinasyonu (198 ve Ser-Thr-199 idiTablo 1). Bu sonuçlar açık bir şekilde protein kinazların fosforilasyon yeri doldurulan malzeme ve ayrıntılı olarak mümkün olan tüm fosforilasyon siteleri karakterize etmek için, tarif edilen protokol yeteneğini göstermektedir.
Bu protokolün en kritik adımlar şunlardır: proteinlerin 1) yeterli çıkarma; PTMS 2) korunması ve hedef protein 3) yeterli miktarda. İlk olarak, proteinlerin yeterli çıkarılması için, sıvı azot içinde doku öğütmek için ve daha sonra protokolde tarif edildiği gibi bir doku homojenleştirici kullanılması önemlidir. Bir doku homojenleştirici mevcut değilse, bir havan ve havaneli kullanılabilir. Bu, üç (veya dört) ekstraksiyon tamponu hacmi doku gram birinden bir oran kullanmak da önemlidir. Oranını ve öneririz yüksek mukavemetli tampon tampon Bu doku, pH çıkarma işlemi sırasında tarafsız kalmayı sağlayacaktır. Bu A için özel öneme sahip olduğu bulundu thaliana ve domates ekstrahiçbir zaman göz ardı 52. PTMS korunması tüm tampon PTMS kaldırabilir enzimlerin uygun inhibitörleri de dahil olmak üzere elde edilebilir. Bu 4 ° C'de tüm adımları gerçekleştirmek ve tamponlar ve araçlar prechill da önemlidir. Hedef proteinin yüksek verimleri yeterli miktarlarda protein eksprese eden bitkiler kullanılarak, doku (yaklaşık 20 g), yüksek miktarda kullanarak elde edilebilir. Hedef proteinin yeterli miktarda elde etmek için en önemli adımı, doğrudan immüno-çökeltme ile hedef proteinin konsantre edilir. Bu adımın önemi nedeniyle Yardımcı bağışık çökeltilmiş Pto (Şekil 2B) sınırlı miktarda bir Prf immunoprecipitation sonra Pto PTMS belirlemek için başarısızlık tarafından vurgulanır. Bunun aksine, Pto doğrudan immüno-protein dizisi ve PTMS (Tablo 1) tanımlanması nedeniyle yaklaşık% 80 içerisinde yol açan önemli ölçüde daha fazla ölçülebilir peptidler (Şekil 2C) vermiştir. Biz de strongly protein immunoprecipitation için epitop-etiketleri kullanmanızı öneririz. Proteinler, doğal epitop afinite matrisi karşı ortaya çıkartılan antikorlar ile karşılaştırıldığında, kısmen saflaştırılmış protein yüksek miktarlarda verebilir. Immüno-çökeltme için yerel Pto protein 51 (Şekil 2A) karşı ortaya çıkan bir antikor kullanarak, Pto iki baskın fosforilasyon siteleri tek tek fosforilasyonunu tespit etmek mümkün oldu.
Bu protokol, esas olarak N. kısmi saflaştırılması için geliştirilmiştir benthamiana sitoplazmik protein ve fosforilasyon siteleri sonraki tespiti. Bununla birlikte, bu tarifnamede tarif edilen modifikasyonları kullanılarak, bu protokol kolayca A. için uyarlanabilir thaliana proteinler ve zara bağlı proteinler. Bu protokol ana amacı PTMS tanımlanması için hedef proteinin yeterli miktarda elde etmek üzere ve karmaşık en yüksek saflık elde etmek için değildir. Eğer daha yüksek saflıktakompleks gereklidir saflaştırılması bir ikinci adım, bu protokol 52 eklenebilir. Bu durumda, bir ilk adım sert elüsyon koşulları gerektiren, yüksek tuzları veya asit kullanımı ve bir sonraki aşamada olmadan afinite matrisinden hedef proteinin elüsyon işlemi ise bir matris gerektirebilir sağlayacaktır. Biz sadece fosforilasyon sitelerinin tanımlanması için bu protokolü test edilmiş ve şu anda ek PTMS ayrıntılı tanımlanması için kabiliyetini test olduğunu olduğunu vurgulamak önemlidir.
Bizim için temsili sonuçlar açık bir şekilde protein kinazların fosforilleme alanı plastisite ve fosforilasyon siteleri karakterize etmek için, tarif edilen protokol yeteneğini göstermektedir. En önemlisi, kütle spektrometrisi ile ve oto-fosforilasyon siteleri tek bir nokta mutasyonu tarafından proteinlerin düşük miktarda güvenmek fosforilasyon siteleri kimlik kafa karıştırıcı sonuçlar verebilir vurgulamak. Biz burada daha önce göstermek 47 </sup> Ser-Thr-198 ve 199 ile ilgili Pto bu çift fosforlama Prf / Pto kompleksinin aktivasyonu ile ilişkilidir. Bunun aksine, daha önce yayınlanmış sonuçlar 47,63 Ser-Thr-198 ve 199 tek bir nokta mutasyonu kompleks aktivasyonu için bir önkoşul, bu siteye bu fosforilasyonunu gösteren işaret yeteneğine sahip olan, bu sitelerde fosforilasyonunu değildir önleyen, alanine göstermiştir . Bu sonuçlar, şu anda ikincil site Thr-195 fosforilasyonu ile açıklanabilir. Diğer protein kinaz fosforilasyon Alanı plastiklik içine Benzer fikir, bu protokol takip edilerek elde edilebilir. Ayrıca, fosforilasyon bölgelerini kullanan bir birleşik yaklaşım mutasyon, protein kinazların fosforilasyon yer plastisite evrimsel öneminin daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır protein immüno ve kütle spektrometre analizleri ile bağlantılı olarak, özel kinazlarının (efektörler) inhibe edebilir proteinlerin etmektedir.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VN Royal Society tarafından desteklenmektedir. JPR bir Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Fellow (FT0992129) 'dir. Biz eleştirel yazının okunması için Dr Miriam Gifford teşekkür ederim.
Materials
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic – 1 M stock in DMSO |
| Syringe 1mL sterile | Terumo | ||
| Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
| Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
| MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
| MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
| Sucrose | Sigma | 16104 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
| EDTA | Sigma | E6758 | toxic – 0.5 M stock |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
| PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
| DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
| PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
| Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic – 1 M stock |
| Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic – Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
| Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
| Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
| anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
| Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
| GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
| Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
| 0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
| D-biotin | Sigma | 47868 | |
| StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
| PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
| Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
| Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
| 2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
| Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
| Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
| Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
| LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |
Referenzen
- Jones, A. M., Monaghan, J., Ntoukakis, V. Editorial: Mechanisms regulating immunity in plants. Front. Plant Sci. 4, 64 (2013).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 33-41 (2004).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation-a 25 year update. Trends Biochem. Sci. 25, 596-601 (2000).
- Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 156-163 (2009).
- Stulemeijer, I. J., Joosten, M. H. Post-translational modification of host proteins in pathogen-triggered defence signalling in plants. Mol. Plant Pathol. 9, 545-560 (2008).
- Park, C. J., Caddell, D. F., Ronald, P. C. Protein phosphorylation in plant immunity: insights into the regulation of pattern recognition receptor-mediated signaling. Front. Plant Sci. 3, 177 (2012).
- van Bentem, S. D., Hirt, H. Using phosphoproteomics to reveal signalling dynamics in plants. Trends Plant Sci. 12, 404-411 (2007).
- Peck, S. C. Early phosphorylation events in biotic stress. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 334-338 (2003).
- Thurston, G., Regan, S., Rampitsch, C., Xing, T. Proteomic and phosphoproteomic approaches to understand plant-pathogen interactions. Physiol. Mol. Plant P. 66, 3-11 (2005).
- Xing, T., Ouellet, T., Miki, B. L. Towards genomic and proteomic studies of protein phosphorylation in plant-pathogen interactions. Trends Plant Sci. 7, 224-230 (2002).
- Nuhse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. Plant J. 51, 931-940 (2007).
- Boller, T., Felix, G. A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors. Ann. Rev. Plant Biol. 60, 379-406 (2009).
- Wang, G., et al. A genome-wide functional investigation into the roles of receptor-like proteins in Arabidopsis. Plant Physiol. 147, 503-517 (2008).
- Wang, G. D., et al. The Diverse Roles of Extracellular Leucine-rich Repeat-containing Receptor-like Proteins in Plants. Crit. Rev. Plant Sci. 29, 285-299 (2010).
- Schwessinger, B., Ronald, P. C. Plant innate immunity: perception of conserved microbial signatures. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 451-482 (2012).
- Schulze, B., et al. Rapid heteromerization and phosphorylation of ligand-activated plant transmembrane receptors and their associated kinase BAK1. J. Biol. Chem. 285, 9444-9451 (2010).
- Lu, D., et al. A receptor-like cytoplasmic kinase, BIK1, associates with a flagellin receptor complex to initiate plant innate immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 496-501 (2010).
- Zhang, J., et al. Receptor-like cytoplasmic kinases integrate signaling from multiple plant immune receptors and are targeted by a Pseudomonas syringae effector. Cell Host Microbe. 7, 290-301 (2010).
- Lu, D., et al. Direct ubiquitination of pattern recognition receptor FLS2 attenuates plant innate immunity. Science. 332, 1439-1442 (2011).
- Asai, T., et al. MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature. 415, 977-983 (2002).
- Rasmussen, M. W., Roux, M., Petersen, M., Mundy, J. MAP Kinase Cascades in Arabidopsis Innate Immunity. Front. Plant Sci. 3, 169 (2012).
- Boudsocq, M., et al. Differential innate immune signalling via Ca2+ sensor protein kinases. Nature. 464, 418-422 (2010).
- Dubiella, U., et al. Calcium-dependent protein kinase/NADPH oxidase activation circuit is required for rapid defense signal propagation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8744-8749 (2013).
- Ishihama, N., Yamada, R., Yoshioka, M., Katou, S., Yoshioka, H. Phosphorylation of the Nicotiana benthamiana WRKY8 transcription factor by MAPK functions in the defense response. Plant Cell. 23, 1153-1170 (2011).
- Mao, G., et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 1639-1653 (2011).
- Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
- Eitas, T. K., Dangl, J. L. NB-LRR proteins: pairs, pieces, perception, partners, and pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 13, 472-477 (2010).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444, 323-329 (2006).
- Boller, T., He, S. Y. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science. 324, 742-744 (2009).
- Bonardi, V., Dangl, J. L. How complex are intracellular immune receptor signaling complexes. Front. Plant Sci. 3, 237 (2012).
- Bonardi, V., Cherkis, K., Nishimura, M. T., Dangl, J. L. A new eye on NLR proteins: focused on clarity or diffused by complexity. Curr. Opin. Immunol. 24, 41-50 (2012).
- Takken, F. L., Albrecht, M., Tameling, W. I. Resistance proteins: molecular switches of plant defence. Curr. Opin. Plant Biol. 9, 383-390 (2006).
- Nakagami, H., et al. Large-scale comparative phosphoproteomics identifies conserved phosphorylation sites in plants. Plant Physiol. 153, 1161-1174 (2010).
- del Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. MAPKKKalpha is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease. EMBO J. 23, 3072-3082 (2004).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
- Romeis, T., et al. Rapid Avr9- and Cf-9 -dependent activation of MAP kinases in tobacco cell cultures and leaves: convergence of resistance gene, elicitor, wound, and salicylate responses. Plant Cell. 11, 273-287 (1999).
- Zhang, S., Klessig, D. F. Resistance gene N-mediated de novo synthesis and activation of a tobacco mitogen-activated protein kinase by tobacco mosaic virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 7433-7438 (1998).
- Romeis, T., Piedras, P., Jones, J. D. G. Resistance gene-dependent activation of a calcium-dependent protein kinase in the plant defense response. Plant Cell. 12, 803-815 (2000).
- Romeis, T., Ludwig, A. A., Martin, R., Jones, J. D. G. Calcium-dependent protein kinases play an essential role in a plant defence response. EMBO J. 20, 5556-5567 (2001).
- Romeis, T. Protein kinases in the plant defence response. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 407-414 (2001).
- Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nat. Rev. Genet. 11, 539-548 (2010).
- Grant, M. R., et al. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science. 269, 843-846 (1995).
- Mackey, D., Holt, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cell. 108, 743-754 (2002).
- Mucyn, T. S., et al. The tomato NBARC-LRR protein Prf interacts with Pto kinase in vivo to regulate specific plant immunity. Plant Cell. 18, 2792-2806 (2006).
- Chung, E. H., et al. Specific threonine phosphorylation of a host target by two unrelated type III effectors activates a host innate immune receptor in plants. Cell Host Microbe. 9, 125-136 (2011).
- Liu, J., Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. A receptor-like cytoplasmic kinase phosphorylates the host target RIN4, leading to the activation of a plant innate immune receptor. Cell Host Microbe. 9, 137-146 (2011).
- Ntoukakis, V., et al. The Tomato Prf Complex Is a Molecular Trap for Bacterial Effectors Based on Pto Transphosphorylation. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Sessa, G., D’Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 3157-3157 (2000).
- Ntoukakis, V., et al. Host Inhibition of a Bacterial Virulence Effector Triggers Immunity to Infection. Science. 324, 784-787 (2009).
- Zhou, J. M., Loh, Y. T., Bressan, R. A., Martin, G. B. The Tomato Gene Pti1 Encodes a Serine/Threonine Kinase That Is Phosphorylated by Pto and Is Involved in the Hypersensitive Response. Cell. 83, 925-935 (1995).
- Wu, A. -. J., Andriotis, V. M. E., Durrant, M. C., Rathjen, J. P. A Patch of Surface-Exposed Residues Mediates Negative Regulation of Immune Signaling by Tomato Pto Kinase. Plant Cell. 16, 2809-2821 (2004).
- Gutierrez, J. R., et al. Prf immune complexes of tomato are oligomeric and contain multiple Pto-like kinases that diversify effector recognition. Plant J. 61, 507-518 (2010).
- Ntoukakis, V., Schwessinger, B., Segonzac, C., Zipfel, C. Cautionary notes on the use of C-terminal BAK1 fusion proteins for functional studies. Plant Cell. 23, 3871-3878 (2011).
- Rommens, C. M., Salmeron, J. M., Oldroyd, G. E., Staskawicz, B. J. Intergeneric transfer and functional expression of the tomato disease resistance gene Pto. Plant Cell. 7, 1537-1544 (1995).
- Jones, A. M., et al. Specific changes in the Arabidopsis proteome in response to bacterial challenge: differentiating basal and R-gene mediated resistance. Phytochemistry. 65, 1805-1816 (2004).
- Widjaja, I., et al. Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low abundance proteins differentially regulated during plant defense. Proteomics. 9, 138-147 (2009).
- Keinath, N. F., et al. PAMP (pathogen-associated molecular pattern)-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Elmore, J. M., Liu, J., Smith, B., Phinney, B., Coaker, G. Quantitative proteomics reveals dynamic changes in the plasma membrane during Arabidopsis immune signaling. Mol. Cell. Proteom. 11, (2012).
- Benschop, J. J., et al. Quantitative phosphoproteomics of early elicitor signaling in Arabidopsis. Mol. Cell. Proteom. 6, 1198-1214 (2007).
- Maor, R., et al. Multidimensional protein identification technology (MudPIT) analysis of ubiquitinated proteins in plants. Mol. Cell. Proteom. 6, 601-610 (2007).
- Elmore, J. M., Coaker, G. Biochemical purification of native immune protein complexes. Methods Mol. Biol. 712, 31-44 (2011).
- Win, J., Kamoun, S., Jones, A. M. Purification of effector-target protein complexes via transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods Mol. Biol. 712, 181-194 (2011).
- Sessa, G., D’Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 2257-2269 (2000).
