식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

주 : 달리 명시하지 않는 한 모든 단계는 상온에서 수행됩니다. 1. 식물 재료 및 버퍼의 준비 N.에 대한 benthamiana 아그로 박테 리움 (이 예에서는 PRF-FLAG, PRF-3xHA, PTO-FLAG 및 제어와 같은 빈 벡터) 28에서 액체 배양 (적절한 항생제 L 매체)에 (200 RPM)을 흔들어 일시적 발현에 대한 관심의 변종을 투메 파시 엔스 성장 고정상 때까지 C를 °. 수집하고 원심 분리 (5 분 3,000 XG)에 의해 아그로 박테리아 펠렛. 뜨는을 취소하고 침투 버퍼에 펠렛 아그로 박테리아를 재현 탁. 600 ㎚의 흡광도에서의 광학 밀도 (OD) 값 (ABS 600 NM)를 획득하여 아그로 박테리아의 양을 측정한다. 0.1 ~ 0.8에 박테리아의 OD를 조정합니다. 사주 오래된 N. 침투 한에 의한 아그로 박테리아와 benthamiana 공장 (22 ° C, 16 시간 등)(1 ㎖의 무 바늘 주사기) 또는 진공 (0.02 % V / V의 계면 활성제를 추가)로 D. 주 : 처음으로 거의 완전히 확장 잎을 사용하고, 가장 효과적인 단백질 발현에 대한 두 개의 즉시 오래된 잎. 유비퀴틴 또는 아세틸 화 단백질의 검출을 위해 100 nm의 MG-132 또는 100 NG / ML Trichostatin A, 각각 1에서 2 일째 침투와 잎에 침투. 침투 잎 2~5일 후 침투와 액체 질소에 동결을 수확. -80 ° C 냉동고에 샘플을 저장합니다. 참고 : 미리 오일의 시간 과정을 통해 샘플을 채취하고 면역 블 롯팅에 의해 단백질 수준을 검출하여 그 단백질의 발현 수준을 결정 유용한. A.에 대한 장대 안정 유전자 변형 라인 A. 성장 6 – 웰 플레이트에있는 장대 씨앗이 잘 당 액체 MS 배지 ​​5 ㎖ (V 자당 / W 1 %)로 보충. 유전자 변형 라인의 다섯 씨앗 (살균 및 계층화)에 세 가지를 넣고관심이나 잘 당 변형되지 않은 제어 라인의. 성장 방에 접시를 전송하기 전에 이틀 동안 200 rpm으로 흔들어는 2 주 (22 ° C에서, 10 시간 등)에 둡니다. 수확 샘플 및 액체 질소에 동결. 참고 : 컨트롤로 관심의 단백질과 같은 태그로 관련이없는 단백질을 발현하는 형질 전환 라인을 사용할 수 있습니다. 버퍼 1 ~ 2 시간 동안 버퍼 A. 드 가스에게 버퍼를 준비합니다 (RLKs를 들어, 다른 막 결합 단백질과 핵 단백질, 1 %의 v / V의 IGEPAL CA-630 53 추가). 참고 : 무기한 4 ° C에서 버퍼를 유지할 수 있습니다. 당신은 트리톤 대신 IGEPAL CA-360 V / 1 % V를 사용할 수 있습니다. 추출하기 전에 차가운 버퍼 B 적어도 1-2 시간의 80 ML을 준비합니다. 참고 : 추출 버퍼 대 조직의 이상적인 비율은 1:4 (W / V)입니다. 2. 단백질 추출 직전 추출에 찬 버퍼 C. 80 ML을 준비 <bR /> 참고 : 유비퀴틴 단백질의 검출을위한 10 μM MG-132을 추가합니다. N. 20 g의 갈기 benthamiana 조직 (약 15 잎) 또는 A. 박격포와 유 봉을 사용하여 액체 질소에 장대 모종 (6 잘 플레이트 당 2~4g). 지상 조직의 20g에 찬 버퍼 C 80 mL를 넣고 잘 섞어 얼음에 해동. 참고 : 같은 시간 (이자 및 제어의 단백질)에서 모든 샘플을 갈기. (4 ° C에서 prechilled) 조직의 균질화와 최고 속도로 10 초마다 3 버스트와 균질화. 4에서 30 분 동안 30,000 XG에 22 ~ 25 ㎛의 조직과 원심 분리기를 통해 필터 ° C. 참고 : 또한, 신선한 prechilled 박격포와 유 봉 균질화. 선호도 행렬의 차단 및 세척 단계는 버퍼 D. 20 ㎖를 준비 4 ℃에서 5 분 동안 1 % BSA를 함유하는 냉각 버퍼 D 500 ㎖를 사용하여 적당한 친 화성 기질의 블록 100 ㎖ ° C. 참고 : 기본 AF를finity 행렬은 안티-FLAG M2 아가로 오스, 스트렙 타비 딘 아가로 오스, GFP-Trap_A 및 안티-HA 아가로 오스 (가) 있습니다. 1 ㎖ 찬 버퍼 D. 씻을 배 얼음에 새 튜브에 0.45 μm의 주사기 필터를 통해 잎 추출물 및 필터의 상층 액을 제거합니다. 참고 : 추출 색깔은 녹색 또는 노란색이어야한다 샘플이 갈색 설정 한 경우, 삭제하고 다시 시작하십시오. , 면역 블롯의 조 추출물의 분취 량을 5 배 SDS-PAGE 로딩 버퍼, 소용돌이를 추가하고 80 ~ 100에서 10 분 동안 끓는 샘플에 의해 변성 열 블록에 C를 °. 3. 단백질 면역 침전 두 개의 50 ㎖ 튜브에 단백질 추출물을 분할하고 각 튜브에 버퍼 D에 현탁 선호도 행렬의 50 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 2 시간 동안 부드러운 회전을 품다 참고 : 긴 배양 수율을 증가 발견되지 않았습니다. 에 추가하여 용출 버퍼 600 μL (친 화성 행렬의 6 배 비드 볼륨)를 준비버퍼 D (최종 농도) : 0.5 % BSA, (항-FLAG M2 아가를위한) 0.25 ㎎ / ㎖의 FLAG 펩티드 또는 (스트렙 타비 딘 아가를위한) 10 mM의 D-비오틴. 참고 : 용출은 GFP-Trap_A 및 안티-HA 행렬의 경우 사용하지 않는 것이 좋습니다, 그래서 1X SDS-PAGE 로딩 버퍼에 끓는 직접 진행, 3.11 단계. 4 ° C (1,000 XG에서 5 분)에서 원심 분리하여 친 화성 기질을 침전. , 이뮤위한 언 바운드 추출물의 분액을 상청액의 나머지를 폐기, 튜브의 저부에 약 500 μl를두기. 넓은 구멍 팁 슬러리 용액을 재현 탁. 하나의 1.5 ML 튜브에 두 튜브의 혼합 슬러리 용액을 전송합니다. 참고 : 이제부터의 미세 튜브를 결합 1.5 ml의 낮은 단백질을 사용합니다. 친 화성 기질을 침전 상층 액을 제거하는 벤치 탑 원심 분리기를 사용하여 5 초 동안 맥박 배. 세척 사이에 1 ㎖ 찬 버퍼 D.로 3 배 씻어 선호도 마트 리에게 침전X로 이전에 설명하고 상층 액을 버린다. 마지막 세척에 주사기의 바늘을 초과 버퍼 D를 제거합니다. 주 : 0.1 % IGEPAL와 버퍼 D를 사용하여, 최종 세척은 더 비특이적 결합을 감소시키기 위해 사용될 수있다. 일정한 진탕 (항-FLAG M2 또는 스트렙 타비 딘 아가로 오스를 참조 단계 3.2) 적절한 용출 버퍼 200 μl의 3 배, 5 분으로 각각의 시간을 용출. 하나의 튜브에 3 용출액 해변. 흡수성 수지의 30 μl를 사용하여 단백질을 집중한다. 소용돌이, 5 분간 방치 수지 (10,000 XG에 2 분)을 침전 할 수 있습니다. 상층 액을 버린다. 참고 : GFP – Trap_A 및 안티-HA 아가로 오스를 들어, 단계 3.9와 3.10를 건너 뜁니다. 침전 된 친 화성 기질 또는 흡수 수지에 1X SDS-PAGE 로딩 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 80 ~ 10 분 동안 소용돌이 끓인다 열 블록에 C를 °. X g 만에 2 분 동안 삶은 친 화성 기질 또는 수지를 원심 분리기. supernatan의 나누어지는 5 μL면역 블롯을위한 T 및 ~ 10cm 길이 SDS-PAGE 겔 (그림 2)에 다른 분수를 실행합니다. 별도의 분리 (그림 2) 필요한 경우 질량 분석에 의한 분리 및 인산화 단백질의 식별을 위해, ~ 19 cm 길이 SDS-PAGE 겔에 나머지 45 μl를로드합니다. 주 : 빈 레인 시료의 오염을 감소시키기 위하여 모든 샘플 사이에 포함 할 수있다. 4. 단백질 소화 콜로이드 쿠마시 브릴리언트 블루 (CCBB) 얼룩 SDS-PAGE 젤 얼룩. 주 : 각질과 오염을 줄이기 위해 겔의 취급을 최소화. 장비 나 도구 중에 면역 블롯 또는 잔류 단백질 오염을 남아있는 수있는 다른 활동에 사용되지 않았 음을 확인합니다. 물에 풍부한 세척, 바람직하게는 O / N.와 젤 Destain 깨끗한 면도날로 젤에서 관심의 밴드를 잘라. 주 : 면역 블롯과 젤을 맞 춥니 경우 necessa올바른 영역을 찾습니다 공예. 인산화는 SDS-PAGE에서 단백질의 이동을 지연시킬 수있는 바로 그 밴드의 위쪽과 아래쪽 영역을 잘라. (이것은 젤 피펫 팁을 차단하지 않고 튜브의 솔루션에 포함되는 것을 보장) 2~4mm의 큐브로 겔 슬라이스를 주사위. 튜브에 넣습니다. 젤 잘 잠수를 유지하는 데 필요한 크기를 예측합니다. 유도체, 단백질 분해 효소와 펩타이드 추출과 배양이 금액을 사용하고 세탁 트리플 볼륨에 두 번을 사용합니다. 참고 : 일반적으로, 컷 젤 조각의 약 100 ㎕ 씩 소화 세탁을 500 μL 솔루션, 탈수 2 × 180 μL, 감소, 알킬화 120 μL, 소화 120 ㎕의 150 μl를 사용합니다. (50 mM의 중탄산 암모늄, ABC의) 50 % 아세토 니트릴을 추가하여 젤 조각 2 X 20 분 (또는 탈 염색시킨까지)를 씻으십시오. 젤 조각을 제거하지 않도록주의하면서 솔루션을 피펫. 100 % 아세토와 탈수5 분 니트릴 무​​료 액체를 제거합니다. 참고 : 젤이 수축과 흰색 나타납니다. 파란색이 지속되면, 아세토 니트릴 / ABC 및 / 또는 높은 온도 (45 ~ 55 ℃)에서 더 이상 품어. 물에 10 mM의 DTT를 첨가하여 단​​백질 이황화 결합을 감소 떨고으로 56 º C에서 30 ~ 45 분 동안 품어. 무료 액체를 제거합니다. 20 ~ 30 분 (실내 온도, 어두운)에 대한 (50 mM의 ABC에서) 55 밀리미터 클로로 아세트 아미드의 첨가에 의한 킬레이트 시스테인 잔기. 무료 액체를 제거합니다. (50 mM의 ABC에서) 50 % 아세토 니트릴로 젤 조각 2 × 10 분을 씻으십시오. 무료 액체를 제거합니다. 5 분 동안 100 % 아세토 니트릴로 젤 조각을 탈수 무료 액체를 제거합니다. 트립신의 경우, 소화 트립신 작업 용액 40 μL (소화 버퍼 트립신 100 NG : 50 mM의 ABC, 평균 매시 묻은 밴드 5 % 아세토 니트릴)를 추가합니다. 젤 조각을 10 분 동안 재수 할 수 있습니다. 필요한 경우 젤 조각을 충당하기 위해 소화 버퍼를 충분히 추가합니다. 37 º C에서 알을 품다O / N. 소화를 중지하고 젤 조각에서 펩타이드를 추출, 5 % 포름산 (50 % 아세토 니트릴) (소화 볼륨과 동일한 볼륨을 추가)를 추가합니다. 5 ~ 10 분 동안 초음파 처리. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 추출 배를 반복합니다. 동결 건조 (권장) 또는 (예 : 속도-Vac 또는 학자 등) 진공 농축기에 의해 펩티드를 건조. -20 º C에서 저장 질량 분석을 위해 샘플을 제출합니다. 참고 : 우리는 세 인스 버리 연구소 (노리치, UK)에서 질량 분석 시설에 샘플을 제출했다. 질량 분석 시설에서 프로토콜은 상당히 다양하지만, 일반적으로 펩티드는 탠덤 질량 분석법을 스프레이보기 ELECTRO하도록 결합 된 액체 크로마토 그래피 시스템 상에 로딩하기 전에 2 % 아세토 니트릴과 0.2 % 트리 플루오로 아세트산에 용해 될 것이다.