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Biologie

Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

Published: February 22, 2014
doi:
10.3791/51095
, , , , ,
1School of Life Sciences,University of Warwick, 2The Sainsbury Laboratory,Norwich Research Park, 3Research School of Biology,The Australian National University

Summary

Nous décrivons ici un protocole pour la purification et la caractérisation de complexes de protéines végétales. Nous démontrons que par immunoprécipitation une seule protéine dans un complexe, afin que nous puissions identifier ses modifications post-traductionnelles et ses partenaires d'interaction.

Abstract

Les plantes s'adaptent rapidement à l'évolution des environnements dus à élaborer perception et des systèmes de signalisation. Au cours de l'attaque pathogène, les plantes réagissent rapidement à l'infection par le recrutement et l'activation de complexes immuns. L'activation des complexes immuns est associée à des modifications post-traductionnelles (PTM) de protéines, telles que la phosphorylation, la glycosylation, ubiquitination ou. Comprendre comment ces MEA sont chorégraphiés conduira à une meilleure compréhension de la façon dont la résistance est atteint.

Nous décrivons ici une méthode de purification de protéines pour la leucine-riche répétition de nucléotides de liaison (NB-LRR) interagissant avec des protéines et l'identification ultérieure de leurs modifications post-traductionnelles (PTM). Avec de petites modifications, le protocole peut être appliqué pour la purification d'autres complexes de protéines végétales. La méthode est basée sur l'expression d'une version à marquage épitopique de la protéine d'intérêt, b, qui est ensuite partiellement purifiéy immunoprécipitation et soumis à la spectrométrie de masse pour l'identification de protéines et de MEA en interaction.

Ce protocole démontre que: i). Des changements dynamiques dans MEA comme la phosphorylation peuvent être détectées par spectrométrie de masse, ii). Il est important de disposer de quantités suffisantes de la protéine d'intérêt, ce qui peut compenser le manque de pureté de l'immunoprécipité, iii). Afin de détecter MEA d'une protéine d'intérêt, cette protéine doit être immunoprécipitée à obtenir une quantité suffisante de protéine.

Introduction

Voies immunitaires s'appuient sur ​​diverses modifications post-traductionnelles (MPT) de protéines pour la transduction de signaux et rapidement activer des réponses immunitaires 1. Les MEA sont rapides, réversibles, et hautement spécifiques des altérations chimiques de la structure des protéines qui peuvent affecter la conformation des protéines, l'activité, la stabilité, la localisation, et des interactions protéine-protéine 4.2. Chez les plantes, plus de 300 types de PTM ont été identifiées, notamment ubiquitination, sumoylation, sulfatation, glycosylation, phosphorylation et 2,5. Un nombre croissant de preuves met en évidence l'importance de la MEA dans différents aspects de l'immunité des plantes 1,5,6. La phosphorylation des protéines, la fixation réversible d'un groupe phosphate à une sérine, thréonine ou tyrosine résidu est un régulateur de nombreuses fonctions cellulaires et sans surprise le plus fortement étudié PTM dans la défense des plantes cascades de signalisation 5-11. La phosphorylation de la signalisation dépendante est une partie intégrale de plante féactivation nse lancé après perception extracellulaire des microbes par des récepteurs transmembranaires, ou la reconnaissance intracellulaire par des protéines de résistance multidomaines 5,8.

Dès plantes envahissantes, les microbes sont détectées par des récepteurs de la membrane plasmique appelées motif reconnaissance récepteurs (PRR) 12. PRR connus sont soit des protéines de type récepteur (RLPS) ou des kinases de récepteurs-like (RLKS), chacune ayant un ectodomaine de liaison au ligand et un domaine transmembranaire à passage unique. Contrairement à RLPS, RLKS ont un domaine kinase intracellulaire 13-15. L'ectodomaine de PRR se lie à des molécules conservées microbe éliciteurs appelées motifs moléculaires associés à des pathogènes (PAMP) principaux, dans le cas de RLKS, à l'autophosphorylation et transphosphorylation dans le domaine intracellulaire 6, 16. En aval de la phosphorylation induite par la perception de-PRR, la phosphorylation ultérieure de protéines kinases cytoplasmiques, notamment 17, </sup> 18, E3 ligases 19, protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK) 20, 21, protéines kinases dépendantes du calcium (CDPK) 22, 23, et les facteurs de transcription 24, 25 conduit à l'immunité PAMP déclenché (PTI).

En plus de la perception par les PRR extracellulaire, intracellulaire reconnaissance des pathogènes est obtenue grâce à des récepteurs cytoplasmiques. Ces protéines résistance multidomaine (R) contiennent un domaine variable N-terminale, un nucléotide contraignant (NB) motif central, et des répétitions riches en leucine C-terminaux (LRR) et donc appelés protéines NB-LRR 26, 27. R protéines directement ou indirectement reconnaissent les molécules de virulence pathogène dérivé appelées effecteurs, également connus pour cibler PRR et d'autres noeuds du système immunitaire. Reconnaissance induit de fortes défenses conduisant à l'immunité effecteur déclenchée (ETI) 28-31. Protéines NB-LRR ont une réquisitionmotif te ATP-binding dans le domaine NB 30, 32, mais ils n'ont pas un domaine kinase. La phosphorylation de domaines conservés de NB-LRR a été rapporté dans un sondage à grande échelle protéomique 33, mais sa pertinence pour ETI n'est pas claire. De même pour PTI, l'activation de protéines NB-LRR conduit à la phosphorylation de protéines cytoplasmiques dont MAPK 34-37 et 38-40 CDPKs. Plus important encore, la reconnaissance d'effecteur peut conduire à une phosphorylation de protéines accessoires qui interagissent directement avec les protéines NB-LRR 41. Quelques exemples incluent RIN4 (Arabidopsis thaliana) et Pto (tomate, Solanum lycopersicum) protéines qui interagissent avec des protéines NB-LRR, RPM1 42, 43 et 44 Prf, respectivement. Au cours de l'infection par les bactéries Pseudomonas syringae, la protéine effectrice AvrB induit la phosphorylation RIN4, très probablement par la kinase de type récepteur RIPK 45, <sup> 46. De même, dans la tomate P. syringae effecteurs AvrPto et AvrPtoB induisent la phosphorylation de Pto 47. Contrairement à RIN4 qui manque un domaine kinase et doit être trans-phosphorylée, Pto est une kinase active capable d'auto-phosphorylation 48 et trans-phosphorylation de substrats 49, 50. Alors que Pto nécessite son activité kinase pour effecteur dépendant initiation de la signalisation, des mutants de Pto kinase-dead sont encore en mesure de signaler d'une manière effecteur indépendant 51. Nous avons récemment expliqué ces observations en démontrant que le complexe Prf / Pto est oligomères, contenant plusieurs Prf et Pto molécules 52 et que les molécules Pto dans le même complexe peuvent trans-phosphorylation de l'autre 47. Nous avons proposé un modèle dans lequel une molécule de Pto (capteur) interagit avec la protéine effectrice, provoquant un changement de conformation de la protéine NB-LRR (Prf) qui active à son tour une seconde molécule de Pto (auxiliaire) de l'esprithin complexe. Par la suite, l'assistant Pto molécule trans-phosphoryle le capteur Pto conduisant à l'activation complète de la résistance complexe 47.

Ces exemples montrent que l'identification des composants de complexes immuns et leurs MEA potentiels sur la reconnaissance de l'effecteur peut conduire à une meilleure compréhension de la façon dont les signaux sont transduction de la perception d'effecteur des cibles en aval. Ici, nous décrivons un procédé de purification de la protéine pour les protéines NB-LRR n'interagissent et l'identification ultérieure de leurs MEA. Nous utilisons Nicotiana benthamiana et le complexe tomate Prf / Pto comme un modèle, mais le même protocole peut facilement être appliquée à RLKS de N. benthamiana et A. thaliana 53 avec de petites modifications comme nous le décrivons dans le protocole.

Protocol

Remarque: toutes les étapes sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Une. Préparation des matières végétales et tampons Pour N. benthamiana La croissance de l'Agrobacterium tumefaciens souches d'intérêt pour l'expression transitoire (dans cet exemple Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG et vecteur vide comme contrôle) par agitation (200 rpm) en culture liquide (L moyen des antibiotiques appropriés) à 28 ° C jusqu'à ce que la phase stationnaire. Recueillir et culot agrobactéries par centrifugation (3000 g pendant 5 min). Rejeter le surnageant et remettre en suspension dans un tampon agrobactéries granulés d'infiltration. Mesurer la quantité d'agrobactéries par l'obtention de la densité optique (DO) de la valeur à une absorbance de 600 nm (Abs 600 nm). Régler la DO de bactéries à 0,1-0,8. Infiltrez âgé de 4 semaines N. plantes benthamiana (22 ° C, 16 h de lumière) avec agrobactéries par hand (avec une seringue sans aiguille 1 ml) ou par le vide (ajouter 0,02% v / v de tensio-actif). Remarque: Utilisez la première feuille quasi intégralement étendu, et les deux feuilles immédiatement âgés d'expression plus efficace des protéines. Pour la détection des protéines ubiquitinées ou acétylés infiltrer feuilles avec 100 nM MG-132 ou 100 ng / ml de trichostatine A, respectivement, à 1 et 2 jours après infiltration. Récolter les feuilles infiltrées 2-5 jours post-infiltration et gel dans de l'azote liquide. Conserver les échantillons dans un congélateur à -80 ° C. Remarque: déterminer le meilleur niveau d'expression de la protéine d'intérêt à l'avance par prélèvement d'échantillons au cours d'une évolution dans le temps de 5 jours et de détecter les niveaux de protéine par immunotransfert. Pour A. thaliana lignées transgéniques stables Cultivez A. thaliana graines dans des plaques 6 puits complétés avec 5 ml de milieu liquide MS (1% w / v) de saccharose par puits. Mettez trois à cinq graines (stérilisés et stratifiés) de la lignée transgéniqued'intérêt ou de la ligne de commande non transformé par puits. Agiter à 200 rpm pendant deux jours avant de transférer la plaque dans une chambre de croissance et laisser reposer pendant 2 semaines (22 ° C, 10 h de lumière). échantillons de récolte et de congélation dans l'azote liquide. Remarque: Vous pouvez utiliser comme un contrôle une lignée transgénique exprimant une protéine sans rapport avec la même étiquette que la protéine d'intérêt. Tampons Préparer le tampon A. De-gaz tampon pendant 1-2 heures (pour RLKS, d'autres protéines liées à la membrane et des protéines nucléaires, ajouter 1% v / v IGEPAL CA-630 53). Remarque: Vous pouvez conserver le tampon A à 4 ° C indéfiniment. Vous pouvez utiliser 1% v / v de Triton au lieu de IGEPAL CA-360. Préparer 80 ml de tampon B froid au moins 1-2 heures avant l'extraction. Note: Le rapport idéal de tissu par rapport à un tampon d'extraction est de 1:4 (p / v). 2. Extraction des protéines Juste avant l'extraction préparer 80 ml de tampon froid C. <br /> Note: Ajouter 10 uM MG-132 pour la détection de protéines ubiquitinées. Broyer 20 g de N. tissu benthamiana (environ 15 feuilles) ou A. thaliana semis (2-4 g par plaque de 6 puits) dans l'azote liquide à l'aide d'un mortier et un pilon. Ajouter 80 ml de tampon froid C à 20 g de tissu du sol, bien mélanger et fondre sur la glace. Remarque: Broyer tous les échantillons en même temps (protéine d'intérêt et de contrôle). Homogénéiser avec 3 salves de 10 secondes à chaque à pleine vitesse avec un homogénéisateur de tissu (préalablement refroidie à 4 ° C). Filtrer à travers un tissu de 22 à 25 um et centrifuger à 30 000 g pendant 30 min à 4 ° C. Remarque: vous pouvez homogénéiser avec un mortier et un pilon préalablement refroidi frais. Pour les étapes blocage et de lavage de la matrice d'affinité, de préparer 20 ml de tampon D. Bloc 100 ml de matrice d'affinité appropriée à l'aide de 500 ml de tampon froid contenant du D BSA à 1% pendant 5 min à 4 ° C. Remarque: af privilégiéesmatrices de Finity comprennent anti-FLAG M2 agarose, la streptavidine agarose, GFP-Trap_A et anti-HA agarose. Laver 3 fois avec 1 ml de tampon froid D. Retirer le surnageant de l'extrait de feuille et le filtre à travers un filtre à seringue de 0,45 um dans un nouveau tube sur glace. Note: La couleur de l'extrait doit être vert ou jaune, si l'échantillon a viré au brun, le jeter et recommencer. Prendre une aliquote de l'extrait brut pour immunoblot, ajouter 5x tampon SDS-PAGE chargement, vortex et dénaturer par des échantillons bouillante pendant 10 min à 80-100 ° C dans un bloc chauffant. 3. Protéine immunoprécipitation Fractionner l'extrait de protéine dans deux tubes de 50 ml et ajouter 50 ul de la matrice d'affinité en suspension dans du tampon D à chaque tube. Incuber avec une légère rotation pendant 2 h à 4 ° C. Remarque: incubations plus longues n'ont pas été trouvés à augmenter le rendement. Préparer 600 ul (6x de volume de la bille de matrice d'affinité) de tampon d'élution par l'addition deTampon D (concentrations finales): 0,5% de BSA, 0,25 mg / ml de peptide FLAG (pour les anti-FLAG M2 agarose) ou 10 mM de D-biotine (pour la streptavidine agarose). Remarque: élution n'est pas recommandé dans le cas de la GFP-Trap_A et anti-HA matrices, afin de passer directement à ébullition en 1x tampon SDS-PAGE chargement, l'étape 3.11. Précipiter la matrice d'affinité par centrifugation à 4 ° C (5 min à 1000 xg). Prendre une aliquote de l'extrait non consolidé pour immunoblot, jeter le reste du surnageant, laissant environ 500 pi dans le fond du tube. Reprendre la solution de suspension avec une pointe de gros calibre. Transférer la solution de suspension mixte des deux tubes à un seul tube de 1,5 ml. Remarque: A partir de maintenant, utiliser 1,5 ml faible teneur en protéines microtubes de liaison. Pulse 3x pendant 5 s à l'aide d'une centrifugeuse de paillasse pour précipiter la matrice d'affinité et d'éliminer le surnageant. Lavez 3-5x avec 1 ml de tampon froid D. Entre les lavages précipiter le matri d'affinitéx de la manière décrite précédemment et jeter le surnageant. Dans le dernier lavage, éliminer l'excès de tampon D avec l'aiguille d'une seringue. Note: Un lavage final à l'aide de tampon D avec 0,1% de IGEPAL peut être utilisé pour réduire encore la liaison non spécifique. Éluer avec 200 pi de tampon d'élution approprié (par anti-FLAG M2 ou streptavidine étape d'agarose 3,2 see 3x), 5 min à chaque fois avec une agitation constante. Réunir les trois éluats dans un seul tube. Concentrer les protéines en utilisant 30 ul de résine d'absorption. Vortex, laisser reposer pendant 5 min et précipiter la résine (2 min à 10000 xg). Jeter le surnageant. Remarque: Pour GFP-Trap_A et anti-HA agarose, sauter les étapes 3.9 et 3.10. Ajouter 50 ul de 1 x tampon de chargement SDS-PAGE à la matrice d'affinité ou une résine précipitée d'absorption. Vortex et faire bouillir pendant 10 min à 80-100 ° C dans un bloc chauffant. Centrifuger la matrice d'affinité ou une résine bouilli pendant 2 min à 10 000 x g. Aliquote 5 pl de la supernatant pour immunoblot, et de fonctionner avec d'autres fractions sur une ~ 10 cm de long gel SDS-PAGE (figure 2). Pour la séparation et l'identification des protéines phosphorylées par spectrométrie de masse, de charger les 45 ul restants sur un gel SDS-PAGE de 19 ~ cm de long, si la séparation supplémentaire est nécessaire (figure 2). Remarque: Une voie vierge peut être comprise entre tous les échantillons pour réduire la contamination des échantillons. 4. La digestion des protéines Colorer le gel SDS-PAGE avec du bleu de Coomassie colloïdal (CCBB) tache. Remarque: Réduire la manipulation du gel afin de réduire la contamination par les kératines. Assurez-vous qu'aucun des appareils ou des outils ont été utilisés pour immunoblot ou d'autres activités qui auraient quitté la contamination de protéines résiduelles. Destain le gel avec lave copieux dans l'eau, de préférence O / N. Couper la bande d'intérêt à partir du gel avec une lame de rasoir propre. Remarque: Alignez le gel avec le immunoblot si necessary pour localiser la zone correcte. Comme la phosphorylation peut retarder la migration des protéines sur SDS-PAGE découper la zone située immédiatement au-dessus et au-dessous de la bande d'intérêt. Couper la tranche de gel en cubes de 2-4 mm (ce qui garantit que le gel sera couvert par des solutions dans le tube sans blocage des embouts de pipette). Placer dans un tube. Estimer le volume nécessaire pour maintenir le gel bien immergée. Utilisez ce montant pour la dérivation, l'incubation avec la protéase et l'extraction de peptide, puis utiliser le double des volumes triples pour le lavage. Remarque: Dans un typique digérer avec environ 100 pi des morceaux de gel de taille, d'utiliser une solution de 500 pl pour le lavage, 2 x 180 ul de la déshydratation, la réduction de 150 ul, 120 ul d'alkylation, et 120 ul de la digestion. Laver les morceaux de gel 2 x 20 minutes (ou jusqu'à ce que décoloré) en ajoutant 50% d'acétonitrile (dans du bicarbonate d'ammonium 50 mM, ABC). Introduire à la pipette, enlever la solution en prenant soin de ne pas enlever des morceaux de gel. Déshydrater à 100% acétonitrile pendant 5 min et éliminer le liquide libre. Remarque: Le gel doit apparaître rétréci et blanc. Si la couleur bleue persiste, plus incuber dans de l'acétonitrile / ABC et / ou à température élevée (45-55 ° C). Réduire les liaisons disulfure de la protéine en ajoutant 10 mM de DTT dans l'eau et incuber pendant 30 à 45 min à 56 ° C avec agitation par secousses. Retirer le liquide libre. Alkyler des résidus de cystéine par addition de 55 mM chloroacétamide (en mM ABC 50) pendant 20-30 min (température de la pièce, foncé). Retirer le liquide libre. Laver les morceaux de gel 2 x 10 min avec 50% d'acétonitrile (en mM ABC 50). Retirer le liquide libre. Déshydrater morceaux de gel avec 100% d'acétonitrile pendant 5 min et éliminer le liquide libre. Pour la digestion trypsique, ajouter 40 ul de solution de travail de la trypsine (100 ng de trypsine dans un tampon de digestion: mM ABC 50, 5% acétonitrile pour une bande moyenne Coomassie teinté). Permettre aux morceaux de gel se réhydrater pendant 10 min. Ajouter suffisamment de tampon de digestion pour couvrir des morceaux de gel si nécessaire. Incuber à 37 º CO / N. Pour arrêter la digestion et l'extraction des peptides à partir des morceaux de gel, ajouter de l'acide formique à 5% (50% dans l'acétonitrile) (ajouter le même volume que le volume de la digestion). Soniquer pendant 5-10 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Répéter l'extraction 3x. Sécher les peptides par lyophilisation (de préférence) ou un concentrateur sous vide (comme Speed-Vac ou Savant). Conserver à -20 ° C. Soumettez votre échantillon pour la spectrométrie de masse. Note: Nous avons présenté notre échantillon à l'installation de spectrométrie de masse au laboratoire Sainsbury (Norwich, Royaume-Uni). Protocoles dans les installations de spectrométrie de masse varient considérablement, mais typiquement peptides sont dissous dans de l'acide trifluoroacétique à 0,2% avec 2% d'acétonitrile avant chargement sur un système de chromatographie liquide couplée à l'électro-pulvérisation couplée à la spectrométrie de masse.

Representative Results

Nous décrivons ici un protocole pour la purification de protéines marquées de stable transgénique A. thaliana lignes ou après l'expression transitoire de protéines dans N. benthamiana. Comme illustré sur la figure 1, la purification de la protéine ciblée est couplée à la spectrométrie de masse pour permettre l'identification de protéines interagissant et le MEA de la protéine ciblée. Le protocole a été conçu pour la purification des protéines impliquées dans l'immunité de la plante et l'identification de leurs MEA, mais peut être appliqué à la purification de toute protéine de plante étiquetée. A titre d'exemple, nous utilisons la purification du complexe Prf / Pto de N. benthamiana. L'transgénique N. ligne benthamiana 38-12 54, exprimant 35S: Pto, a été transitoirement transformée avec 35S: Prf-FLAG et le complexe a été immunoprécipités avec anti-FLAG M2 agarose (figure 2A). Les immuno-empreintes (IB) de la figure 2Aillustrent le fait que la majeure partie de la protéine ciblée (Prf) a été immunoprécipitée. Pto et la protéine effectrice interagissant avec AvrPtoB ont été copurifiés Prf et détectée en utilisant des anticorps et analyse par spectrométrie de masse (figures 2A et 2B). Nous avons constaté que la prise de force que copurifiés avec Prf migré plus lente sur gel SDS-PAGE quand coexprimé avec l'effecteur construit 35S: AvrPto et 35S: AvrPtoB (figure 2A). Les deux protéines effectrices induites migration plus lente de la prise de force interagissant avec Prf (Figure 2A). Cette reconnaissance effecteur dépendant lente migration de Pto a déjà été attribué à la phosphorylation comme il pourrait être éliminé par traitement avec la phosphatase 44. Pour détecter les sites de phosphorylation qui contribuent à la lente migration de prise de force, nous avons soumis le copurifying Prf Pto pour analyse par spectrométrie de masse. Malgré la forte expression de Pto et sa détection facile avec immunoblots nous pourrions récupérer peptides cOvering seulement 57% de la séquence Pto et nous pas réussi à identifier des sites de phosphorylation (figure 2B). Par la suite, nous avons changé les stratégies pour cibler la protéine Pto anti-FLAG. N. plantes benthamiana WT ont été transformées de façon transitoire avec 35S: Prf-3HA et 35S: Pto-FLAG, avec ou sans 35S: AvrPto et 35S. AvrPtoB Le montant total de la protéine Pto, comprenant à la fois le Prf complexé et les formes libres, était immunoprécipité avec anti-FLAG M2 agarose et soumis à une SDS-PAGE, le fractionnement, en-gel digestion trypsique et analyse par spectrométrie de masse (Figure 2C). Avec cette approche, nous avons identifié des peptides Pto couvrant environ 80% de sa séquence et un 100 kDa protéine interagissant inconnu. Nous avons identifié un ensemble de sites de phosphorylation simples et doubles pour les peptides 187-202 et 188-202 Pto (tableau 1). Ser et Thr-198-199 sont les sites de phosphorylation, mais prédominantes autre phosphorylation sites ont également été détectés (tableau 1). Le plus important à double phosphorylation sur Ser et Thr-198-199 a été identifié seulement en présence de l'une protéine effectrice (tableau 1). Nous avons récemment identifié un ensemble similaire de sites de phosphorylation Pto et illustré l'importance de l'événement double phosphorylation de signalisation 47. En suivant le protocole décrit ici, nous avons pu identifier les changements dynamiques dans l'état de la protéine cible de la phosphorylation. Figure 1. Conception expérimentale général. L'protéine cible pour l'immunoprécipitation (IP) est étiqueté et exprimé dans la plante, de manière transitoire dans Nicotiana benthamiana ou stable chez Arabidopsis thaliana. Après l'extraction de la protéineprotéine cible est immunoprécipité avec une matrice d'affinité. Les protéines sont séparées sur un gel d'acrylamide par électrophorèse. bandes de gel sont excisées. Les protéines sont extraites à partir des bandes de gel et soumis à une spectrométrie de masse. les sites de phosphorylation et les protéines qui interagissent sont identifiés. Cliquez ici pour agrandir l'image. Figure 2. Prf et Pto immunoprécipitation. A). La construction 35S: Prf-FLAG a été transitoirement exprimé dans 38-12 ligne (35S: PTO) avec vecteur vide (EV), 35S: AvrPto ou 35S: AvrPtoB. Trois jours après l'infiltration Prf a été immunoprécipité utilisant des anticorps anti-FLAG matrice d'affinité. Immunoblots (IB) pour Prf, AvrPtoB et Pto ont été réalisées. Comme indiqué par les flèches en bas de tableau de immunoblot Pto, AvrPto et AvrPtoB induisent une migration plus lente de la prise de force. B). La construction 35S: Prf-FLAG a été transitoirement exprimé dans 38-12 ligne (35S: PTO) avec vecteur vide (EV), 35S: AvrPto ou 35S: AvrPtoB. Trois jours après l'infiltration Prf a été immunoprécipité en utilisant l'agarose anti-FLAG et séparés sur SDS-PAGE. Le gel a été coloré avec du bleu de Coomassie Brilliant colloïdale (CCBB) et le Prf visible, prise de force et AvrPtoB protéines bandes ont été excisées du gel et analysées par spectrométrie de masse. La couverture de peptide de pourcentage de prise de force et Prf séquences identifiées par spectrométrie de masse est indiquée. C). Les constructions 35S: Prf-3xHA et 35S: Pto-FLAG ont été exprimés transitoirement avec 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto ou vecteur vide (EV) en N. benthamiana. Trois jours après l'infiltration du montant total dePto-FLAG a été immunoprécipité utilisant des anticorps anti-FLAG agarose et résolu sur SDS-PAGE. Le Pto visible et Pto-interagissant bandes de protéine ont été excisées du gel et analysées par spectrométrie de masse. Prise de force et la bande de protéine de 100 kDa Pto-interaction sont clairement visibles sur la Coomassie colloïdal Brilliant Blue (CCBB)-gel teinté, alors que Prf est un peu moins visible (comme indiqué par les flèches). IP: immunoprécipitation; IB: immunoblot; CBB: Coomassie coloration bleu; CCBB: colloïdal Coomassie coloration bleue. Cliquez ici pour agrandir l'image. Prf EV AvrPto AvrPtoB Pto peptide 188-202 GTELDQ [p T 195] HLSTVVK <td> 1 1 0 GTELDQTHL [p S 198] TVVK 10 7 5 GTELDQTHLS [p T 199] VVK 8 3 4 G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK 0 1 2 GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK 0 8 4 GTELDQTHLSTVVK 46 26 48 Pto peptide 187-202 KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK 0 1 0 KGTELDQTHL [p S 198] TVVK 17 17 12 KGTELDQTHLS [p T 199] VVK </td> 4 2 2 KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK 0 1 1 KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK 0 7 5 KGTELDQTHLSTVVK 21 37 18 Peptides 187-202 et 188-202 83 88 50 Pourcentage de peptides avec deux événements de phosphorylation 0% 26,9% 11,2% Pto couverture séquence 78% 79% 82% Tableau 1 double phosphorylation d'un peptide Pto lors de l'activation de la signalisation 35S:.. Prf-3xHA et 35S: Pto-FLAG ont exprimé de façon transitoire avec luipty vecteur (EV), 35S: AvrPto ou 35S: AvrPtoB en N. benthamiana. Trois jours après l'infiltration de la quantité totale de protéine Pto-FLAG a été immunoprécipité utilisant des anticorps anti-FLAG matrice d'affinité et résolu sur SDS-PAGE. Les bandes visibles de Pto sur le gel colloïdal Coomassie colorée en bleu ont été excisées et analysées avec la spectrométrie de masse. Le nombre de peptides identifiés Pto avec 0, 1, et 2 événements de phosphorylation est indiqué. Table des tampons L milieu Tryptone 10 g / L Extrait de levure 5 g / L NaCl 5 g / L D-glucose 1 g / L Tampon agro-infiltration MgCl2 10 mM MES </Td> 10 mM Ajuster à pH 5,5 Acétosyringone (facultatif) 150 uM Tampon A Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl 150 mM EDTA 5 mM EGTA 2 mM Glycérol 5% (v / v) Tampon B Tampon A PVPP 2% (p / v) Tampon C Tampon B Dithiothréitol (DTT) 10 mM Usine d'inhibiteur de protéase Cocktail 1% (v / v) fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) 0,5 mM </td> Un calyculine 50 nM Le fluorure de sodium (NaF) 50 mM molybdate de sodium (Na 2 MoO 4) 10 mM Sodium orthovanadate 1 mM Acide okadaïque 100 nM Tampon D Tampon C sans PVPP Tampon de chargement 5x SDS-PAGE Tris-HCl pH 6,8 60 mM SDS 2% Glycérol 0,15% Bleu de bromophénol 0,10% TNT (ajouter juste avant utilisation) 50 mM Tableau 2. Tampon et recettes des médias.

Discussion

Élucider le mécanisme d'activation du récepteur par les PAMP et les effecteurs peut grandement contribuer à notre compréhension de l'immunité de la plante. Au cours des 20 dernières années, les écrans de deux hybrides génétiques et la levure ont contribué à la découverte de PRR et protéines NB-LRR. Plus récemment, des protocoles basés sur la spectrométrie de masse ont été établies pour l'identification de protéines réglementée différemment au cours de signalisation 55-58 immunitaire, leurs MEA 11,33,59,60, la composition de complexes immuns 61 et effecteur cible 62. Ici, nous décrivons un protocole simple pour l'identification des PTM régulation de l'activation des complexes immuns.

En comparaison avec les protocoles décrits précédemment, ce protocole permet l'identification détaillée des changements dynamiques de PTM. Protocoles des approches de protéomique à grande échelle peuvent identifier MEA de protéines, mais ne sont pas en mesure de révéler le site plasticité de PTM en raison de limitered quantités de protéines. Dans le cas de la phosphorylation des protéines, à grande échelle approches protéomiques en général seulement d'identifier les sites de phosphorylation prédominantes 11,33,59. La caractérisation détaillée d'un statut de phosphorylation de protéine nécessite une quantité importante de protéine qui peut être obtenue seulement par purification partielle de la protéine cible 47. Le protocole décrit ici des couples d'une approche de purification de protéine qui produit une quantité substantielle de la protéine cible, avec analyse par spectrométrie de masse de la protéine purifiée. Après ce protocole, l'événement de phosphorylation unique de prise de force a été attribuée principalement à la Ser-198 comme décrit précédemment 52 mais certains spectres de spectrométrie de masse a également soutenu un événement unique phosphorylation sur Thr-195 ou Thr-199. Lorsque doubles événements de phosphorylation de Pto ont été observés, la combinaison prédominante des acides aminés phosphorylés a Ser-198 et Thr-199 bien que des combinaisons sur d'autres sites ont également été observées (Le tableau 1). Ces résultats démontrent clairement le site de phosphorylation de la plasticité des protéines kinases et la capacité du protocole décrit en détails pour caractériser tous les sites de phosphorylation possibles.

Les étapes les plus importantes de ce protocole sont: 1) l'extraction suffisante de protéines; 2) la protection des PTM, et 3) une quantité suffisante de protéine cible. Tout d'abord, pour l'extraction suffisante des protéines, il est important de broyer le tissu dans de l'azote liquide et par la suite d'utiliser un homogénéiseur de tissus tel que décrit dans le protocole. Si un homogénéisateur de tissu n'est pas disponible, un mortier et un pilon peuvent être utilisés. Il est également important d'utiliser un rapport de un à trois (ou quatre) de grammes de tissu au volume de tampon d'extraction. Ce tissu de tamponner rapport et le tampon à haute résistance que nous proposons permettra d'assurer que le pH restera neutre durant le processus d'extraction. Nous avons trouvé que cela est d'une importance particulière pour A. thaliana et tomate supplémentairections 52. Protection de MEA peut être obtenue en incluant dans tous les tampons des inhibiteurs d'enzymes appropriées qui peuvent éliminer MEA. Il est également essentiel d'effectuer toutes les étapes à 4 ° C et à prérefroidissement tampons et des instruments. Des rendements plus élevés de la protéine cible peuvent être obtenus en utilisant des plantes exprimant la protéine dans des quantités suffisantes et en utilisant des quantités élevées de tissu (environ 20 g). L'étape la plus importante pour l'obtention de quantités suffisantes de protéine cible concentre la protéine cible par immunoprécipitation directe. L'importance de cette étape est mise en évidence par notre incapacité à identifier les PTM de Pto après une immunoprécipitation Prf en raison de la quantité limitée de coimmunoprecipitated Pto (figure 2B). En revanche, une immunoprécipitation directe de peptides a abouti à Pto sensiblement plus mesurables (Figure 2C) menant à une couverture d'environ 80% de la séquence de la protéine et l'identification des MEA (tableau 1). Nous avons également strecommander rongly l'utilisation des épitopes-tags pour les protéines immuno-précipitation. En comparaison avec des anticorps dirigés contre les protéines matrice épitope-tags affinité native peut produire de plus grandes quantités de protéine partiellement purifiée. En utilisant un anticorps dirigé contre la protéine native de prise de force 51 (figure 2A) pour immunoprécipitation, nous avons pu identifier que la phosphorylation seul des deux sites de phosphorylation prédominantes de Pto.

Ce protocole a été principalement développé pour la purification partielle de N. benthamiana protéine cytoplasmique et l'identification ultérieure de leurs sites de phosphorylation. Cependant, en utilisant les modifications décrites ici, ce protocole peut être facilement adapté pour A. protéines thaliana et des protéines membranaires. L'objectif principal de ce protocole est de produire des quantités suffisantes de la protéine cible pour l'identification des PTM et de ne pas atteindre la plus grande pureté du complexe. Si une plus grande puretédu complexe est requise une deuxième étape de purification peut être ajouté à ce protocole 52. Dans ce cas, une première étape va permettre l'élution de la protéine cible à partir de la matrice d'affinité sans l'utilisation de sels élevées ou à l'acide et l'étape ultérieure peut comporter une matrice, ce qui nécessite des conditions d'élution dures. Il est important de souligner que nous avons seulement testé ce protocole pour l'identification des sites de phosphorylation et que nous testons actuellement sa capacité d'identification détaillée des PTM supplémentaires.

Nos résultats démontrent clairement représentatives du site de phosphorylation de la plasticité des protéines kinases et la capacité du protocole décrit pour caractériser les sites de phosphorylation. Surtout, ils soulignent que l'identification des sites de phosphorylation s'appuyant en basse quantité de protéines par spectrométrie de masse et par des mutations ponctuelles de sites auto-phosphorylation peut donner des résultats étonnants. Nous montrons ici et auparavant 47 </sup> Que la double phosphorylation de Ser-Pto sur 198 et Thr-199 est associée à l'activation du complexe Prf / Pto. En revanche, les résultats publiés antérieurement 47,63 ont montré que des mutations ponctuelles de Ser et Thr-198-199 par l'alanine, ce qui empêche la phosphorylation de ces sites, sont en mesure de signaler ce qui suggère que la phosphorylation de ces sites n'est pas une condition préalable à l'activation complexe . Ces résultats peuvent maintenant être expliquées par la phosphorylation du site secondaire Thr-195. Idée similaire dans le site de phosphorylation de la plasticité d'une autre protéine kinase peut être obtenu suivant ce protocole. En outre, une approche combinée en utilisant les sites de phosphorylation mutations ponctuelles, des protéines qui peuvent inhiber les kinases spécifiques (effecteurs) couplés avec immunoprécipitation de protéines et analyse par spectrométrie de masse conduira à une meilleure compréhension de l'importance de l'évolution du site de phosphorylation plasticité des protéines kinases.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VN est pris en charge par la Royal Society. JPR est un futur membre (FT0992129) Conseil australien de la recherche. Nous remercions le Dr Miriam Gifford pour la lecture critique du manuscrit.

Materials

MgCl2 Sigma M8266
MES Sigma M8250
Acetosyringone Sigma D134406 toxic – 1 M stock in DMSO
Syringe 1mL sterile Terumo
Syringe needle Terumo NN-2525R 
Silwet L-77 (surfactant) Lehle Seeds VIS-01 toxic
MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) Sigma C2211 1 M stock in DMSO, store at -80 °C
MS salts Sigma M5524 oxidizing, toxic
Sucrose Sigma 16104
Trizma base Sigma T1503 adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer
NaCl Sigma S3014 5 M stock
EDTA Sigma E6758 toxic – 0.5 M stock
EGTA Sigma E4378
Glycerol National Diagnostics EC-606
IGEPAL CA-630 Sigma I8896 corrosive
PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) Sigma P5288 do not confuse with PVP
DTT (DL-dithiothreitol) Sigma 43815 toxic – 1 M stock, store at -20 °C
Plant protease inhibitor cocktail Sigma P9599 do not freeze/thaw too many times
PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) Sigma P7626 corrosive, toxic
Calyculin A Cell Signaling Technology 9902
Sodium Fluoride (NaF) Sigma S7920 toxic – 1 M stock
Sodium Molybdate (Na2MoO4) Sigma S6646 0.5 M stock
Sodium orthovanadate (Na3VO4) Sigma 450243 toxic – Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. 
Okadaic acid Santa Cruz Biotechnology sc-3513
Kinematica Polytron tissue homogeniser Fisher Scientific 08-451-320 
Miracloth Merck Millipore 475855-1R 
anti-FLAG M2 agarose Sigma A2220 this matrix is recommended
Streptavidin-agarose Thermo-Scientific 20347 this matrix is recommended
GFP-Trap_A Chromotek gta-20 this matrix is recommended
Anti-HA-Agarose Sigma A2095 this matrix is recommended
0.45 μm filter VWR 513-1902
BSA Sigma A7906
FLAG peptide Sigma F3290
D-biotin Sigma 47868
StrataClean resin Agilent 400714 this absorption resin is recommended for protein precipitation
Mini-PROTEAN Tetra Cell Biorad
PROTEAN II XL Cell Biorad
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 this stain is recommended
Protein low-binding tubes (LoBind) Eppendorf 0030 108.116 these tubes are recommended
Ammonium bicarbonate (ABC) Sigma 9830 toxic
Acetonitrile VWR 83639 toxic, flammable
2-chloroacetamide Sigma 22790 toxic
Trypsin Promega V5280 irritant, sensitizing
Formic acid Sigma 14265 toxic, corrosive
Water-bath sonicator Ultravawe Ultra BT Ultrasonic Bath
LTQ-Orbitrap XL Thermo-Scientific
Trichostatin A Sigma T8552 toxic
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Piquerez, S. J. M., Balmuth, A. L., Sklenář, J., Jones, A. M., Rathjen, J. P., Ntoukakis, V. Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes. J. Vis. Exp. (84), e51095, doi:10.3791/51095 (2014).
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