Détection du génome et des transcriptions d'un virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ L'hybridation combinée avec immunocoloration

Type de virus de l'herpès simplex 1 (HSV-1) est un virus persistant neurotrope humain, l'établissement d'une infection latente à long terme dans les neurones du ganglion de Gasser (TG) du système nerveux périphérique, à partir de laquelle il réactive périodiquement de se répliquer et se propager. Le génome de HSV-1 est un ADN double brin de 150 kb localisation dans le noyau du neurone de l'hôte où il reste des plasmides multicopies comme chromatinized, qui ne s'intègrent pas dans le génome de la cellule hôte ^1,2. Au cours de la latence, le programme génétique de HSV-1 cycle réplicatif est fortement réprimée, et l'expression des gènes est limitée à la transcription associé à la latence (LAT) locus, à partir de l'établissement de la latence initiation de réactivation ^3. LAT produit une longue 8,5 kb non codantes de l'ARN transformé en un 2 ko lasso majeur stable, et plusieurs miARN ^4-7. HSV-1 de latence se caractérise donc par la présence de l'ADN viral génomique, ARN LAT, et l'absence de protéines du cycle de replication détectables.

ontenu "> modèles animaux, principalement la souris et le lapin, sont des modèles expérimentaux récapitulant quelques éléments sur la latence chez l'homme. L'un des principaux intérêts de ces modèles est qu'ils permettent d'étudier les aspects physiologiques de HSV-1 de latence dans les sujets immunocompétents. cours des dernières décennies , de nombreux outils expérimentaux, tels que des virus et des souris génétiquement modifiées, ont été développées pour étudier la physiologie, de la génétique et de la biologie cellulaire de HSV-1 de latence, à partir de tissus animaux. Jusqu'à présent, l'ADN génomique viral a été détecté et quantifié par transfert de Southern et qPCR de dissocier les TG. Toutefois, il n'existe actuellement aucune méthode pour détecter le HSV-1 génomique par hybridation in situ sur des coupes de tissu ^8. En conséquence, la latence est couramment évaluée sur des coupes histologiques par la détection de l'ARN LAT par hybridation d'ARN in situ, plutôt que la détection du génome viral. Comme il a été impossible de caractériser les cellules infectées en fonction de la présence de génomes viraux, this limitation technique a été un inconvénient majeur pour l'analyse de nombreux aspects des interactions hôte-virus, tels que la relation entre le génome viral et l'expression cellulaire et virale ou gène de l'hôte à médiation cellulaire réponse immunitaire ^9,10.

Plus important encore, l'hétérogénéité de l'infection latente de cellule à cellule reste relativement inexploré et a été montré pour être un élément clé de la latence chez la souris et dans les neurones ganglionnaires sensorielles humaines implantées dans des souris SCID ^11-17. En règle générale, il a été montré par qPCR que le génome de HSV-1 du nombre de copies par cellule varie de 5 à plusieurs centaines. Bien que LAT apparaît comme un régulateur clé de la latence et la réactivation, les données qPCR sur les neurones isolés et en PCR in situ ont indiqué que seul un sous-ensemble de neurones infectés de manière latente, aussi bas que 30%, exprime le locus LAT ^11,12,18-21. Comment la cellule hôte et l'environnement cellulaire à l'intérieur de l'impact de la mise en place sur le tissu de la latence du virus etexpression des gènes viraux reste incertaine. Nous décrivons ici un solide hybridation fluorescente in situ (FISH) de la méthode pour la détection efficace de la copie de faible HSV-1 de l'ADN génomique à l'intérieur des sections de tissus neuronaux animales dans. Cette méthode a été conçue et utilisée par nous pour obtenir l'accès à haut microscopie imagerie de résolution qui est nécessaire pour étudier l'interaction du génome viral avec les cellules de l'hôte composants intra-nucléaires ^22. En outre, nous décrivons un procédé de coloration multiple pour la détection simultanée de l'ADN viral à ARN et des protéines, qui est un outil unique pour décrire les interactions virus-hôte qui régulent l'expression des gènes viraux. La méthode peut également être appliquée à un large éventail d'analyses nécessitant la détection de HSV-1 génome latent, comme la quantification des neurones infectés dans grand nombre de sections. Une étape clé est d'appliquer un traitement de récupération de l'antigène de faire l'ADN viral accessible à l'hybridation. Ainsi, ce protocole pourrait également être efficace pour la détectiond'autres virus ADN double brin, qui ne sont actuellement pas détectable par des approches ADN-FISH conventionnels dans les tissus animaux.