Точная настройка размера и Минимизация шума полупроводниковых нанопор
Summary
Методология подготовки полупроводниковых нанопор в растворе для биомолекулярных экспериментов транслокационных представлена. Применяя короткие импульсы сильных электрических полях, диаметр нанопор может быть контролируемо пополнился субнанометровой точностью и его электрическая шумовые характеристики значительно улучшены. Эта процедура выполняется на месте с использованием стандартного лабораторного оборудования в экспериментальных условиях.
Abstract
Полупроводниковых нанопор появились как универсальный инструмент для характеристики отдельных биомолекул, таких как нуклеиновые кислоты и белки 1. Тем не менее, создание нанопор в тонкого изоляционного мембраны остается сложной. Способы изготовления с участием специализированных систем целенаправленной электронных лучей может производить четкие нанопор, но выход надежных и малошумных нанопор в коммерчески доступных мембран остается низким 2,3 и контроль размер нетривиально 4,5. Здесь, применение сильных электрических полях для тонкой настройки размер нанопор при одновременном обеспечении оптимальной производительности с низким уровнем шума демонстрируется. Эти короткие импульсы сильного электрического поля используются для производства нетронутой электрический сигнал и позволяют для увеличения нанопор с точностью субнанометровой на длительном воздействии. Этот способ выполняется на месте в водной среде с помощью стандартного лабораторного оборудования, повышение урожайности и воспроизводимость снанопор изготовление Olid-государство.
Introduction
Биологическое и полупроводниковых нанопор обеспечивают средства зондирования биомолекулярные анализируемых на уровне одной молекулы 1. Индивидуальные нанопор, как правило, встроены в изолирующих мембран, обеспечивая только трубопровод для ионного тока, чтобы пройти между двумя жидкими водоемов. Используя принципы крупномасштабных Coulter счетчиков, нанопор эксперименты касаются изменений в ионного тока для определения длины, размер, заряд и конформации заряженных биомолекул, как они электрофореза приводом через нанопоры в присутствии внешнего электрического поля.
В то время как биологические нанопор, такие как α-гемолизина как правило, предлагают более высокую чувствительность и низким уровнем шума свойства 3, поддерживая липидный бислой является хрупким и фиксированный размер, что ограничивает их применение. Полупроводниковых нанопор, с другой стороны, изготовлены в тонкой (10-50 нм) нитрида кремния или оксида кремния мембран и может быть изготовлена из различных SIZэс, легко интегрируется с пластины масштабных технологий 6,7, и являются более надежными, что позволяет использовать более широкий спектр экспериментальных условиях. Несмотря на эти преимущества, технологии твердотельных нанопор страдают от ряда практических недостатков, которые ограничивают их полезность для биомолекулярных исследований. В то время как контроль размера нанопор возможно, оно, как правило, дорого и трудоемко для достижения, требуя специального оборудования и квалифицированного персонала. Например, нанопоры, пробуренные сфокусированного ионного пучка были недавно показано, чтобы уменьшить при определенных экспериментальных условиях в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) 5. В других подходах, нанопор, пробуренные с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) может увеличить или уменьшить в зависимости от условий пучка и последующего воздействия водных растворителях 8. В этих случаях достижима диапазон размеров нанопор ограничен, трудно контролировать, и даже ненадежны как размер нанопор может изменить следующий химической обработки илипри погружении в определенной жидкой среде 9.
Ионный ток через полупроводниковых нанопор также могут страдать от повышенного шума, источники которых интенсивно исследуются темы в нанопор литературы 2,3,10,11. В то время как различные методы были предложены для уменьшения электрического шума, доходность надежных, стабильных малошумящих нанопор как правило, низка. Отложение углеродистых остатков в процессе бурения и обработки изображений могут иметь пагубные последствия для электрической качества сигнала, часто делая полное смачивание вызов и вызывая образование нанопузырьков, которые могут быть трудно удалить 12. Кроме того, засорение нанопор молекулами анализируемого вещества ухудшает качество сигнала рендеринга поры непригодным для дальнейшего эксперимента 13,14. В целом, эти эффекты значительно уменьшить выход функциональных устройств нанопор и увеличивает затраты, связанные с исследованиями твердотельного нанопор.
Применимостьции напряжения с Ag / AgCl электроды для получения высоких электрических полей в диапазоне 0,15-0,3 V / нм представляет собой удивительно простое решение этих проблем. Через циклического применения коротких импульсов напряжения, чистой, с низким уровнем шума нанопор поверхности идеально подходит для одиночных молекул исследований производится. Продолжительное воздействие высоких электрических полей инициирует удаление мембранного материала, образующего стенки поры, в результате чего увеличение диаметра нанопор. Этот рост может быть точно управлять, подстраивая силу и длительности импульса. Поскольку текущие следы ухудшить течение эксперимента из-за засорения нанопор как молекулы адсорбируются на поверхности нанопор, этот процесс может повторяться для восстановления забиты устройства, которые иначе были бы отброшены. Таким образом, доходность функциональных нанопор дополнительно увеличивается за счет возможности использовать то же устройство несколько раз. Этот способ имеет несколько преимуществ, как он быстро выполняется в жидкости под экспериментальныеусловия, требуется только стандартный лабораторного оборудования, могут быть автоматизированы с помощью программного обеспечения, а также производит функциональные высококачественные нанопор с выходом более 95%.
Protocol
Representative Results
Discussion
Контроль размера нанопор имеет принципиальное значение в приложениях биомолекулярных зондирования. Диаметры нанопор должна быть порядка размеров молекул зондируемой; они должны быть достаточно большим, чтобы вместить образец, но достаточно малы, чтобы достичь оптимального шум сигнал-. В то время как контроль размера с использованием метода подарил применения высоких электрических полей является однонаправленным в том, что диаметров нанопор только увеличивается на протяжении всего процесса, нанопор диаметром от 3-100 нм может быть вылепленный, с точностью субнанометровой. Как 3-4 нм поры могут быть легко изготовлены с использованием ПЭМ 23, это позволяет для надежного изготовления полупроводниковых нанопор для широкого диапазона приложений от зондирующего структуру оцДНК взаимодействию громоздких белок-лиганд. В то время как рост нанопор выше 100 нм может быть очень быстрым и менее точным, более умеренные условия, увеличивающие могут быть использованы для достижения лучшего контроля над процессом. Как суч, самый важный шаг для достижения эффективного контроля размер является выбор силы и длительности импульса, чтобы сбалансировать увеличения эффективности и уровня точности, требуемой для достижения желаемого диаметра пор. Это еще более подчеркивается расширения тонких нанопор (толщина 10-нм), где увеличение наблюдается более низкий уклон, но сопоставимый напряженность электрического поля. В зависимости от окончательного размера, как правило, можно увеличить нанопоры диаметрам суб-100 нм в течение нескольких минут.
Точно так же, большие низкочастотные колебания тока исключает одной молекулы исследования, как это почти невозможно отличить транслокационные сигналы от фонового шума. Неполное смачивания 24, наличие углеродистых остатков, оставшихся после первоначальной изготовления 25 и адсорбции мусора на нанопор стенки 13 может ухудшить качество сигнала, что требует дополнительной очистки с резкими химических обработок, которые часто яnefficacious. Интересно, что он является общим для протоколы твердотельные нанопор, чтобы подчеркнуть важность очистки нанопор в пираньи растворе или с кислородной плазмы перед установкой, чтобы помочь смачивание или удалить любые загрязнения, оставшиеся от процессов бурения, обработки изображений и обработки. Даже с этим лечение, однако, нанопор часто не мокрой или продолжают демонстрировать высокую шум, и предложил решение для неудачных попыток, чтобы выполнить дополнительную очистку, которая может быть очень много времени 14. С применением высоких электрических полей, эти длинные протоколы не может быть необходимым в зависимости от применения. Было установлено, что большинство устройств может быть восстановленные на месте с использованием метода, описанного здесь, следовательно уменьшая время подготовки и необходимость иметь дело с агрессивных химикатов. Наиболее важные шаги в смягчении электрический шум является простое увеличение напряжения и / или длительности импульса, чтобы полностью смочить поры и удалить слабо связанных мусора.Нанопоры обработанные таким образом надежно могут быть использованы в экспериментах биомолекулы транслокации, таких, как прохождении ДНК и белков. Если эти молекулы придерживаться стенки поры, ведущие к забитой и шумной электрический сигнал, высокие импульсы электрического поля могут быть восстановлены, чтобы удалить препятствия и восстановить свойства с низким уровнем шума для дальнейших экспериментов, без размонтирования чипа нанопор от жидкостной ячейке.
Применение сильных электрических полях на установке, описанной ограничивается требованием внешнего источника питания, которые могут применять до 10 V и усилителя тока, в которых отсутствуют чувствительность и свойства с низким уровнем шума при высокой пропускной способностью (> 1 кГц) для зондирования одной молекулы. В то время как типичные биомолекулярные эксперименты полагаться на текущей малошумящий усилитель, которая ограничена ± 1 В, это несложно спроектировать единую систему, которая может выполнить как высокую кондиционирование электрического поля и чувствительной измерения тока с ADJUстабильный прирост. Несмотря на это ограничение, переход от одной установки на другую быстро и просто. По сравнению с существующими методами для управления размером нанопор такие как использование SEM 5, термического окисления и мембраны переформирования 8, высокие электрические поля предлагаем быстрое и более точное и менее дорогой методологию, которая может быть выполнена и в лаборатории с использованием стандартного оборудования и обеспечить более широкий диапазон размеров нанопор. Способность быстро и воспроизводимо снизить низкочастотный шум и делает первоначальный изготовление более надежным и продлевает срок службы полупроводниковых нанопор, как ранее используемые поры может быть обновленным для дальнейших экспериментов. В общей сложности, более 95% нанопор различной толщины условных с сильных электрических полях демонстрировала очень слабую низкочастотного шума характеристику, что делает их подходящими для биомолекул зондирования. Изготовление, таким образом, проще и надежнее, делая эксперименты твердотельные нанопор более ДоступнаяBLE для исследователей и потенциально позволяя для пути к коммерциализации нанопор технологий посредством более надежных процессов изготовления.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем поддержку по естественным наукам и инженерным исследовательского совета Канады, Канадского фонда инноваций, и Научно-исследовательского фонда Онтарио. Мы благодарим Y. Liu для помощи в изготовлении нанопор и характеристики, Л. Анджеевский за полезные обсуждения и технической поддержки, и А. Marziali за помощь в нанопор программного обеспечения и дизайна приборов.
Materials
| JEM-2100F TEM | JEOL | Drilling requires 200 kV accelerating voltage | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | Low-noise voltage and current amplifier | |
| X-Series data acquisition card | National Instruments | PCI-6351 | Interfacing with setup, apply of high electric fields |
| LabVIEW 2012 software | National Instruments | Apply voltages, record current, data analysis | |
| Current amplifier | Keithley | Current amplification during high electric field pulses | |
| 30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005X | Substrate in which nanopores are created |
| 10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005Z | Substrate in which nanopores are created |
| Silicone elastomer O-rings | Marian Chicago | HT6135 | Punched for sealing the nanopore chip |
| Ag/AgCl electrodes | In Vivo Metric | E255 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 52004P | Used for cleaning cells – handle with caution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H323 | Used for piranha solution – handle with caution |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | Used for piranha solution – handle with caution |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P335 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | Buffering KCl solution |
| Primary Faraday cage | Shielding nanopore cell, electrodes | ||
| Secondary Faraday cage | Shielding headstage, electrode wires | ||
| Teflon cell | To hold nanopore chip and reservoirs | ||
| Hot plate | VWR | Heating piranha solution |
Referenzen
- Venkatesan, B. M., Bashir, R. Nanopore sensors for nucleic acid analysis. Nat. Nanotechnol. 6 (10), 615-624 (2011).
- Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Dekker, N. H., Dekker, C. Noise in Solid-State Nanopores. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (2), 417-421 (2008).
- Tabard-Cossa, V., Trivedi, D., Wiggin, M., Jetha, N. N., Marziali, A. Noise analysis and reduction in solid-state nanopores. Nanotechnology. 18, 4484-4418 (2007).
- Wu, M. -. Y., et al. Control of Shape and Material Composition of Solid-State Nanopores. Nano Lett. 9 (1), 479-484 (2009).
- Prabhu, A. S., Freedman, K. J., Robertson, J. W. F., Nikolov, Z., Kasianowicz, J. J., Kim, M. J. SEM-induced shrinking of solid-state nanopores for single molecule detection. Nanotechnology. 22, 425302 (2011).
- Li, J., Stein, D., McMullan, C., Branton, D., Aziz, M. J., Golovchenko, J. A. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412 (6843), 166-169 (2001).
- Rosenstein, J. K., Wanunu, M., Merchant, C. A., Drndic, M., Shepard, K. L. Integrated nanopore sensing platform with sub-microsecond temporal resolution. Nat. Methods. 9 (5), 487-492 (2012).
- Vanden Hout, M., Hall, A. R., Wu, M. Y., Zandbergen, H. W., Dekker, C., Dekker, N. H. Controlling nanopore size, shape and stability. Nanotechnology. 21, 115304 (2010).
- Li, Q., et al. Size evolution and surface characterization of solid-state nanopores in different aqueous solutions. Nanoscale. 4 (5), 1572-1576 (2012).
- Smeets, R., Dekker, N., Dekker, C. Low-frequency noise in solid-state nanopores. Nanotechnology. 20, 095501 (2009).
- Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Precise control of the size and noise of solid-state nanopores using high electric fields. Nanotechnology. 23 (40), 405301 (2012).
- Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Wu, M. Y., Dekker, N. H., Dekker, C. Nanobubbles in Solid-State Nanopores. Phys. Rev. Lett. 97 (8), 088101 (2006).
- Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-Molecule Observation of Protein Adsorption onto an Inorganic Surface. J. Am. Chem. Soc. 132 (31), 10816-10822 (2010).
- Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560 (2011).
- Wanunu, M., Meller, A. . Single-molecule analysis of nucleic acids and DNA-protein interactions. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , 395-420 (2008).
- Tabard-Cossa, V. Instrumentation for Low-Noise High-Bandwidth Nanopore Recording. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , 59-93 (2013).
- Kowalczyk, S. W., Grosberg, A. Y., Rabin, Y., Dekker, C. Modeling the conductance and DNA blockade of solid-state nanopores. Nanotechnology. 22 (31), 315101 (2011).
- Siwy, Z., Fuliński, A. Origin of 1/fα Noise in Membrane Channel Currents. Phys. Rev. Lett. 89 (15), 158101 (2002).
- Liebes, Y., et al. Reconstructing solid state nanopore shape from electrical measurements. Appl. Phys. Lett. 97 (22), 223105 (2010).
- Kim, M. J., Wanunu, M., Bell, D. C., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniformly Sized Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18 (23), 3149-3153 (2006).
- Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Krapf, D., Wu, M. -. Y., Dekker, N. H., Salt Dekker, C. Dependence of Ion Transport and DNA Translocation through Solid-State Nanopores. Nano Lett. 6 (1), 89-95 (2006).
- Wanunu, M., Dadosh, T., Ray, V., Jin, J., McReynolds, L., Drndić, M. Rapid electronic detection of probe-specific microRNAs using thin nanopore sensors. Nat. Nanotechnol. 5 (11), 807-814 (2010).
- Dekker, C. Solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 2 (4), 209-215 (2007).
- Powell, M. R., Cleary, L., Davenport, M., Shea, K. J., Siwy, Z. S. Electric-field-induced wetting and dewetting in single hydrophobic nanopores. Nat. Nanotechnol. 6 (12), 798-802 (2011).
- Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35 (6), 399-409 (2004).
