صقل الحجم والتقليل من الضوضاء من الحالة الصلبة ثقوب النانو
Summary
يتم تقديم منهجية لإعداد ثقوب النانو الحالة الصلبة في حل للتجارب إزفاء الجزيئية البيولوجية. من خلال تطبيق نبضات قصيرة من الحقول الكهربائية عالية، وقطرها ثقب النانو يمكن تكبير controllably بدقة subnanometer وخصائص الضوضاء الكهربائية قد تحسن بشكل ملحوظ. يتم تنفيذ هذا الإجراء في الموقع باستخدام المعدات المختبرية القياسية تحت ظروف تجريبية.
Abstract
ظهرت ثقوب النانو الحالة الصلبة بوصفها أداة متعددة الاستعمالات لتوصيف الجزيئات الحيوية واحدة مثل الأحماض النووية والبروتينات 1. ومع ذلك، فإن إنشاء ثقب النانو في غشاء رقيقة عازلة لا يزال تحديا. أساليب التصنيع التي تنطوي على نظم شعاع الالكترون تركيزا المتخصصة يمكن أن تنتج ثقوب النانو واضحة المعالم، ولكن العائد من ثقوب النانو موثوقة ومنخفضة الضوضاء في الأغشية المتاحة تجاريا لا يزال منخفضا 2،3 والتحكم في حجم هو غير بديهي 4،5. هنا، وتطبيق مجالات كهربائية عالية لصقل ويتجلى حجم ثقب النانو مع ضمان الأداء الأمثل منخفضة الضوضاء. وتستخدم هذه نبضات قصيرة من حقل كهربائي عالي لإنتاج إشارة كهربائية البكر وتسمح لتوسيع ثقوب النانو من الدقة مع subnanometer عند التعرض لفترات طويلة. يتم تنفيذ هذا الأسلوب في الموقع في بيئة مائية باستخدام المعدات المختبرية القياسية، وتحسين العائد واستنساخ من لياليالدولة شهيد ثقب النانو تلفيق.
Introduction
توفير ثقوب النانو الحالة الصلبة البيولوجية ووسائل الاستشعار عن بعد التحاليل البيولوجية في الجزيء مستوى واحد 1. وعادة ما تكون جزءا لا يتجزأ من ثقوب النانو الفردية في أغشية رقيقة عازلة، وتوفير قناة للتيار الأيونية فقط لتمرير بين خزانين السائل. الاستفادة من مبادئ عدادات كولتر على نطاق أوسع، والتجارب ثقب النانو تتصل التغييرات في الأيونية الحالية لتحديد طول وحجم وتهمة والتشكل من الجزيئات الحيوية مشحونة لأنها هي التي تحرك electrophoretically من خلال ثقب النانو في وجود مجال كهربائي خارجي.
بينما ثقوب النانو البيولوجية مثل α-حالة دموية عادة ما تقدم حساسية أكبر وخصائص منخفضة الضوضاء 3، ودعم طبقة ثنائية الدهن لا يزال هشا وحجم ثابت، مما يحد من تطبيقها. من ناحية أخرى هي ملفقة ثقوب النانو الحالة الصلبة، في رقيقة (10-50 نانومتر) نيتريد السيليكون أو أغشية أكسيد السيليكون، ويمكن أن تكون مصنوعة من الاحجام المختلفةوفاق، أن تكون متكاملة بسهولة مع التكنولوجيات رقاقة النطاق 6،7، وأكثر قوة، والسماح لمجموعة واسعة من الظروف التجريبية. على الرغم من هذه المزايا والتقنيات ثقب النانو الحالة الصلبة تعاني من عدة عيوب العملية التي تحد من فائدتها للدراسات الجزيئية البيولوجية. في حين السيطرة على حجم ثقب النانو هو ممكن، وأنها مكلفة عادة وشاقة لتحقيق، وتتطلب معدات متخصصة والموظفين المهرة. على سبيل المثال، حفر ثقوب النانو التي كتبها تركز أيون شعاع وقد ثبت مؤخرا أن يتقلص تحت ظروف تجريبية محددة في المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) 5. في المناهج الأخرى، ويمكن حفر ثقوب النانو عن طريق المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) توسيع أو تقليص تبعا للظروف شعاع والتعرض للمذيبات اللاحقة مائي 8. في هذه الحالات، ومجموعة للتحقيق من أحجام ثقب النانو محدودة، من الصعب السيطرة عليها، وحتى لا يمكن الاعتماد عليها كما حجم النانو يمكن أن تتغير بعد العلاج الكيميائي أوعندما مغمورة في البيئة السائلة خاصة 9.
التيار الأيونية من خلال ثقوب النانو الحالة الصلبة يمكن أيضا يعانون من الضوضاء العالية، مصادر التي تشكل موضوع التحقيق بشكل مكثف في ثقب النانو الأدب 2،3،10،11. في حين تم اقتراح أساليب مختلفة للحد من الضوضاء الكهربائية، العائد من موثوقة ومستقرة ثقوب النانو منخفضة الضوضاء منخفض عادة. ترسب بقايا كربونية أثناء الحفر والتصوير يمكن أن يكون لها آثار ضارة على جودة الإشارة الكهربائية، وغالبا ما يجعل التبول كاملة تحديا والتسبب في تشكيل nanobubbles التي يمكن أن يكون من الصعب إزالة 12. علاوة على ذلك، انسداد ثقب النانو جزيئات الحليلة يحط تقديم جودة الإشارة المسام غير صالحة للاستعمال لمزيد من التجربة 13،14. تماما، وهذه الآثار الحد بشكل كبير من العائد من أجهزة النانو وظيفية وزيادة التكلفة المرتبطة بالبحوث ثقب النانو الحالة الصلبة.
والتطبيقاتنشوئها من الجهد مع أقطاب حج / أجكل لإنتاج الحقول الكهربائية عالية في حدود 0،15 حتي 0،3 الخامس / نانومتر يقدم حلا بسيطا من المستغرب لهذه التحديات. وينتج من خلال تطبيق دوري من نبضات الجهد قصيرة، نظيفة، وانخفاض الضوضاء مثالية سطح ثقب النانو للدراسات جزيء واحد. التعرض لفترات طويلة لمجالات كهربائية عالية يبدأ إزالة المواد التي تشكل غشاء جدار المسام، مما أدى إلى زيادة في القطر ثقب النانو. هذا النمو يمكن التحكم بدقة عن طريق ضبط قوة النبض ومدتها. كما اثار الحالي تتحلل على مدى التجربة بسبب انسداد ثقب النانو كما كثف الجزيئات على سطح ثقب النانو، ويمكن تكرار هذه العملية لاسترداد أجهزة انسداد التي من شأنها أن خلاف ذلك تم التخلص منها. على هذا النحو، هو زيادة العائد من ثقوب النانو وظيفية مزيدا من القدرة على استخدام نفس الجهاز عدة مرات. وهذه الطريقة توفر العديد من المزايا كما يتم تنفيذ ذلك بسرعة في السائل تحت التجريبيةالظروف، يتطلب معدات المختبرات القياسية فقط، يمكن أن يكون آليا مع البرمجيات، وتنتج ثقوب النانو وظيفية عالية الجودة مع تحقيق عائد أكثر من 95٪.
Protocol
Representative Results
Discussion
السيطرة على حجم ثقب النانو هي ذات أهمية أساسية في تطبيقات الاستشعار الجزيئية البيولوجية. يجب أن يكون أقطار ثقب النانو بناء على أمر من حجم الجزيئات التي يجرى التحقيق فيها، بل يجب أن تكون كبيرة بما يكفي لاستيعاب العينة ولكن صغيرة بما يكفي لتحقيق الضوضاء إشارة إلى المستوى الأمثل. في حين أن السيطرة على حجم باستخدام طريقة عرض تطبيق المجالات الكهربائية عالية في اتجاه واحد في تلك الأقطار ثقب النانو هي زيادة فقط في جميع أنحاء هذه العملية، يمكن ثقوب النانو بأقطار بين 3-100 نانومتر يكون الطراز، مع الدقة subnanometer. كما 3-4 المسام نانومتر يمكن أن تكون ملفقة بسهولة باستخدام TEM 23، وهذا يسمح لتصنيع موثوقة من ثقوب النانو الحالة الصلبة لمجموعة واسعة من التطبيقات من التحقيق هيكل ssDNA للتفاعل المجمعات البروتين يجند ضخمة. في حين أن النمو ثقب النانو فوق 100 نانومتر يمكن أن تكون سريعة جدا وأقل دقة، وظروف توسيع أكثر اعتدالا يمكن توظيفها لتحقيق سيطرة أفضل على العملية. كما قاوك، أهم خطوة لتحقيق التحكم في حجم فعالة هو اختيار قوة النبض ومدتها من أجل تحقيق التوازن الكفاءة تضخيم ومستوى الدقة المطلوبة في تحقيق قطر المسام المطلوب. ويزيد من إبراز ذلك من خلال توسيع ثقوب النانو أرق (سمك 10 نانومتر)، حيث لوحظ تضخم تحيز أقل ولكن مقارنة قوة الحقل الكهربائي. اعتمادا على الحجم النهائي، فمن الممكن عموما لتكبير ثقب النانو لأقطار شبه 100 نانومتر في بضع دقائق.
وبالمثل، التقلبات الحالية التردد المنخفض كبيرة تحول دون دراسات جزيء واحد لأنه يكاد يكون من المستحيل تمييز إشارات إزفاء من الضوضاء في الخلفية. التبول غير مكتملة 24، وجود بقايا كربونية المتبقية بعد التصنيع الأولي 25 و الامتزاز من الحطام على الجدار ثقب النانو 13 يمكن أن تتحلل جودة الإشارة، الأمر الذي يتطلب تنظيف إضافية مع العلاجات الكيميائية القاسية التي غالبا ما تكون طnefficacious. ومن المثير للاهتمام، فإنه من الشائع للبروتوكولات ثقب النانو الحالة الصلبة إلى التأكيد على أهمية تنظيف ثقب النانو في حل سمكة البيرانا أو البلازما مع الأكسجين قبل التركيب لمساعدة ترطيب أو إزالة أي تلوث من مخلفات عمليات الحفر والتصوير والتعامل معها. حتى مع هذا العلاج، ولكن في كثير من الأحيان لا ثقوب النانو الرطب أو مواصلة إبداء ضوضاء عالية، والحل المقترح لمحاولات فاشلة هو إجراء التنظيف الإضافية التي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا جدا 14. مع تطبيق مجالات كهربائية عالية، قد لا تكون هذه البروتوكولات مطولة اللازمة اعتمادا على التطبيق. تبين أن معظم الأجهزة يمكن مجددة في الموقع باستخدام الطريقة الموصوفة في هذه الوثيقة، وبالتالي تقليل الوقت اللازم لإعداد والحاجة للتعامل مع المواد الكيميائية القاسية. أهم الخطوات في تخفيف الضجيج الكهربائي هو زيادة بسيطة في الجهد و / أو مدة النبضة الرطب تماما المسام وإزالة الأنقاض ملزمة فضفاضة.يمكن موثوق ثقوب النانو يعامل بهذه الطريقة يمكن استخدامها في التجارب إزفاء جزيء حيوي، مثل مرور الحمض النووي والبروتينات. إذا كانت هذه الجزيئات التمسك جدار المسام مما يؤدي إلى إشارة كهربائية انسداد وصاخبة، والبقول الحقل الكهربائي عالية يمكن إعادة استخدامها لإزالة انسداد واستعادة خصائص منخفضة الضوضاء لمزيد من التجريب، دون إزالة تجهيز للرقاقة ثقب النانو من الخلية فلويديك.
تطبيق مجالات كهربائية عالية باستخدام الإعداد وصفها محدودة بسبب اشتراط وجود امدادات الطاقة الخارجية التي يمكن أن تنطبق تصل إلى 10 V ومكبر للصوت الحالي، والتي تفتقر إلى الحساسية وخصائص منخفضة الضوضاء في النطاق الترددي العالي (> 1 كيلو هرتز) ل الاستشعار عن جزيء واحد. بينما التجارب الجزيئية البيولوجية نموذجية تعتمد على مكبر للصوت الضوضاء المنخفضة الحالية التي تقتصر على ± 1 V، فإنه واضح ومباشر لتصميم نظام واحد يمكن أن تنجز على حد سواء الكهربائية عالية تكييف الميدان والقياس الحالي الحساسة مع adjuمكاسب مستقرة. على الرغم من هذا القيد، والانتقال من الإعداد واحدة إلى أخرى سريعة ومباشرة. بالمقارنة مع التقنيات الحالية للسيطرة على حجم ثقب النانو مثل استخدام SEM 5، الأكسدة الحرارية والأغشية إعادة تشكيل 8، المجالات الكهربائية عالية توفر منهجية أسرع وأكثر دقة وأقل تكلفة التي يمكن القيام بها على مقاعد البدلاء المختبر باستخدام المعدات القياسية وتوفير مجموعة واسعة من الأحجام ثقب النانو. القدرة بسرعة وبتكاثر للحد من الضوضاء التردد المنخفض أيضا يجعل تصنيع الأولي أكثر موثوقية ويطيل عمر ثقوب النانو الحالة الصلبة، كما المسام المستخدمة سابقا يمكن شبابها لمزيد من التجارب. تماما، أكثر من 95٪ من ثقوب النانو من سمك متفاوتة مكيفة مع المجالات الكهربائية عالية أظهرت القليل جدا مميزة ضوضاء منخفضة التردد، مما يجعلها مناسبة لجزيء حيوي الاستشعار عن بعد. تلفيق وبالتالي أسهل وأكثر موثوقية، مما يجعل التجارب ثقب النانو الحالة الصلبة أكثر accessiبلي للباحثين وربما السماح للمسار نحو تسويق التكنولوجيات ثقب النانو من خلال عمليات تصنيع أكثر قوة.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف الدعم من جانب العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا، والمؤسسة الكندية للإبداع، وصندوق البحوث أونتاريو. نشكر Y. ليو للحصول على مساعدات في تصنيع النانو وتوصيف، L. Andrzejewski للمناقشات قيمة والدعم التقني، وA. Marziali للمساعدة مع برنامج النانو وتصميم الأجهزة.
Materials
| JEM-2100F TEM | JEOL | Drilling requires 200 kV accelerating voltage | |
| Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | Low-noise voltage and current amplifier | |
| X-Series data acquisition card | National Instruments | PCI-6351 | Interfacing with setup, apply of high electric fields |
| LabVIEW 2012 software | National Instruments | Apply voltages, record current, data analysis | |
| Current amplifier | Keithley | Current amplification during high electric field pulses | |
| 30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005X | Substrate in which nanopores are created |
| 10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005Z | Substrate in which nanopores are created |
| Silicone elastomer O-rings | Marian Chicago | HT6135 | Punched for sealing the nanopore chip |
| Ag/AgCl electrodes | In Vivo Metric | E255 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 52004P | Used for cleaning cells – handle with caution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H323 | Used for piranha solution – handle with caution |
| Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | Used for piranha solution – handle with caution |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P335 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | Buffering KCl solution |
| Primary Faraday cage | Shielding nanopore cell, electrodes | ||
| Secondary Faraday cage | Shielding headstage, electrode wires | ||
| Teflon cell | To hold nanopore chip and reservoirs | ||
| Hot plate | VWR | Heating piranha solution |
Referenzen
- Venkatesan, B. M., Bashir, R. Nanopore sensors for nucleic acid analysis. Nat. Nanotechnol. 6 (10), 615-624 (2011).
- Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Dekker, N. H., Dekker, C. Noise in Solid-State Nanopores. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (2), 417-421 (2008).
- Tabard-Cossa, V., Trivedi, D., Wiggin, M., Jetha, N. N., Marziali, A. Noise analysis and reduction in solid-state nanopores. Nanotechnology. 18, 4484-4418 (2007).
- Wu, M. -. Y., et al. Control of Shape and Material Composition of Solid-State Nanopores. Nano Lett. 9 (1), 479-484 (2009).
- Prabhu, A. S., Freedman, K. J., Robertson, J. W. F., Nikolov, Z., Kasianowicz, J. J., Kim, M. J. SEM-induced shrinking of solid-state nanopores for single molecule detection. Nanotechnology. 22, 425302 (2011).
- Li, J., Stein, D., McMullan, C., Branton, D., Aziz, M. J., Golovchenko, J. A. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412 (6843), 166-169 (2001).
- Rosenstein, J. K., Wanunu, M., Merchant, C. A., Drndic, M., Shepard, K. L. Integrated nanopore sensing platform with sub-microsecond temporal resolution. Nat. Methods. 9 (5), 487-492 (2012).
- Vanden Hout, M., Hall, A. R., Wu, M. Y., Zandbergen, H. W., Dekker, C., Dekker, N. H. Controlling nanopore size, shape and stability. Nanotechnology. 21, 115304 (2010).
- Li, Q., et al. Size evolution and surface characterization of solid-state nanopores in different aqueous solutions. Nanoscale. 4 (5), 1572-1576 (2012).
- Smeets, R., Dekker, N., Dekker, C. Low-frequency noise in solid-state nanopores. Nanotechnology. 20, 095501 (2009).
- Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Precise control of the size and noise of solid-state nanopores using high electric fields. Nanotechnology. 23 (40), 405301 (2012).
- Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Wu, M. Y., Dekker, N. H., Dekker, C. Nanobubbles in Solid-State Nanopores. Phys. Rev. Lett. 97 (8), 088101 (2006).
- Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-Molecule Observation of Protein Adsorption onto an Inorganic Surface. J. Am. Chem. Soc. 132 (31), 10816-10822 (2010).
- Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560 (2011).
- Wanunu, M., Meller, A. . Single-molecule analysis of nucleic acids and DNA-protein interactions. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , 395-420 (2008).
- Tabard-Cossa, V. Instrumentation for Low-Noise High-Bandwidth Nanopore Recording. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , 59-93 (2013).
- Kowalczyk, S. W., Grosberg, A. Y., Rabin, Y., Dekker, C. Modeling the conductance and DNA blockade of solid-state nanopores. Nanotechnology. 22 (31), 315101 (2011).
- Siwy, Z., Fuliński, A. Origin of 1/fα Noise in Membrane Channel Currents. Phys. Rev. Lett. 89 (15), 158101 (2002).
- Liebes, Y., et al. Reconstructing solid state nanopore shape from electrical measurements. Appl. Phys. Lett. 97 (22), 223105 (2010).
- Kim, M. J., Wanunu, M., Bell, D. C., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniformly Sized Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18 (23), 3149-3153 (2006).
- Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Krapf, D., Wu, M. -. Y., Dekker, N. H., Salt Dekker, C. Dependence of Ion Transport and DNA Translocation through Solid-State Nanopores. Nano Lett. 6 (1), 89-95 (2006).
- Wanunu, M., Dadosh, T., Ray, V., Jin, J., McReynolds, L., Drndić, M. Rapid electronic detection of probe-specific microRNAs using thin nanopore sensors. Nat. Nanotechnol. 5 (11), 807-814 (2010).
- Dekker, C. Solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 2 (4), 209-215 (2007).
- Powell, M. R., Cleary, L., Davenport, M., Shea, K. J., Siwy, Z. S. Electric-field-induced wetting and dewetting in single hydrophobic nanopores. Nat. Nanotechnol. 6 (12), 798-802 (2011).
- Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35 (6), 399-409 (2004).
