無傷アダルトゼブラフィッシュの脳における電気生理学的記録
Summary
本論文では、成人のゼブラフィッシュは、固定化された挿管、無傷の動物における記録と神経活動の操作を可能にするためのin vivo電気生理学的実験のために使用する方法について説明します。
Abstract
以前は、大人のゼブラフィッシュにおける電気生理学的研究では、準備をスライスまたはアイカップ製剤およびelectrorentinogramの録音をするために限られていた。本論文では、神経活動の記録を可能と大人のゼブラフィッシュは、固定化された挿管、およびin vivoでの電気生理学的実験のために使用する方法について説明します。大人の固定化は、頬やふたの運動の代わりにエラに溶存酸素を届けるためのメカニズムが必要です。我々の手法では、動物を固定し、この要件を満たすために生息地の水で灌流した。脳へのアクセスを提供するために、麻酔、開頭術を、トリカインメタンスルホネート（トリカインMS-222）の下で行われる。次電極は、次いで、細胞外脳活動を記録するために開頭ウィンドウ内に配置される。多管灌流システムを使用することにより、薬理学的化合物の種々の成魚に投与することができ、神経活性の任意の変化観察することができる。方法論は、神経学的活性の変化について説明するための観察を可能にするだけでなく、比較は幼虫および成体ゼブラフィッシュの間でなされることがまた可能にする。これは研究者により異なるライフステージでの様々な化合物の導入に神経学的活性の変化を識別することが可能になります。
Introduction
この記事では、プロトコルは、成人のゼブラフィッシュにおける神経活動のin vivoでの録音に得るために記載されている。細胞外記録方法は、神経組織の小領域内の電気的活動の電圧測定を提供するために使用される。調査のこの方法は、動物の挙動1に多数のセルを監視することを含む。以前は、スライス記録はアイカップ製剤および電図記録を持っているとして、大人と幼虫の両方で行われている。これらの実験は、主に様々な感覚系2-5の生理学的反応が詳細に行われている。最近まで、完全な脳標本は、呼吸と酸素の拡散が皮膚を通って発生する可能性がゼブラフィッシュの幼虫3,6,7、と電気生理学を実行するために利用されてきた。動物が完全に意識してOを意識したまま私たちの準備は大人のゼブラフィッシュのネイティブ神経学的活性を測定することができますFその周辺。
ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） は、現在、遺伝毒性学、薬理および生理病理学的研究3のモデルとして基本的な役割を果たしている。彼らは遺伝、神経および内分泌レベル8での哺乳類との広範な相同性を共有しているため、ゼブラフィッシュは、神経科学の分野内での可視性を得ています。過去10年間で、標準的な神経解剖学的、および免疫組織化学的技法は、ゼブラフィッシュ神経系9-12の異なる神経伝達物質3,8,13の分布の詳細な特徴構成を決定するために使用されている。さらに最近では、研究者は行動のプロセス16〜19と感覚系2,13,20の電気生理学的特性を中心にその多くは機能的研究14,15、に焦点をシフトしている。これらの研究の少数ADULの特定領域の電気的活動に集中しているゼブラフィッシュ脳21-23トンが、in vivoでのアプローチを使用して実施されなかった。
このプロトコルは、特定の脳領域における活動のパターンを説明するためのゼブラフィッシュ神経系内で自発および誘発の両方の活性の電気生理学的研究のために適合させることができる。この技術の使用は、比較は若い幼虫期と成人の神経学的活性との間に行うことを可能にする。さらに、我々のプロトコルは、遺伝的または薬理学的変化との比較を可能にします。一緒にこのような遺伝子工学や薬理試験などの他のアプローチと、この方法は完全な成体動物においてだけでなく、このような遅発性てんかんや神経変性プロセスを研究などの潜在的なアプリケーションのために、神経細胞のコミュニケーションと可塑性の機能解析のための新たな可能性を提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、 インビボで 、成体ゼブラフィッシュの神経活動を測定するために使用されてきた。記録された活動の特性（振幅やイベントの形状が）個々の魚の間で変化させることができるものの実際に、神経活動は、一貫して観察することができます。細胞外記録技術の利用は、この観察を説明することができます。この方法は、地域1内の細胞が多数の同時モニタリ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、（TMD、JDLとATに）、NIH / NINDS助成R01NS070159によってサポートされていました。
Materials
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
Referenzen
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