הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה
Summary
מאמר זה מתאר כיצד יכול להיות משותק דג הזברה מבוגר, מחוברת לצינורות, ומשמש לניסויי in vivo אלקטרו לאפשר הקלטות ומניפולציה של פעילות עצבית בבעלי חיים בשלמותה.
Abstract
בעבר, מחקרי אלקטרו בדג זברה מבוגר היו מוגבלים לחתוך תכשירים או להכנות כוס העין והקלטות electrorentinogram. מאמר זה מתאר כיצד יכול להיות משותק דג הזברה מבוגר, מחוברת לצינורות, ומשמש לניסויי in vivo אלקטרו, המאפשר הקלטה של פעילות עצבית. חוסר תנועה של המבוגר דורש מנגנון כדי לספק חמצן מומס לזימים במקום תנועת buccal וopercular. בעזרת הטכניקה שלנו, בעלי חיים הם משותקים וperfused עם מים בסביבה כדי למלא דרישה זו. פתיחת גולגולת מתבצעת תחת methanesulfonate tricaine (MS-222; tricaine) הרדמה כדי לספק גישה למוח. האלקטרודה הראשית אז ממוקמת בתוך חלון פתיחת הגולגולת כדי להקליט את פעילות מוח תאית. באמצעות השימוש במערכת זלוף multitube, מגוון רחב של תרכובות תרופתיים יכול להינתן לדגים בוגרים וכל שינויים בפעילות העצביתניתן לצפות. המתודולוגיה לא רק מאפשרת לתצפיות שנעשו לגבי שינויים בפעילות נוירולוגית, אבל זה גם מאפשר להשוואות שנעשו בין הזחל ודג זברה מבוגר. זה נותן לחוקרים את היכולת לזהות השינויים בפעילות עצבית עקב כניסתה של תרכובות שונות בשלבי חיים שונים.
Introduction
במאמר זה, פרוטוקול מתואר לקבלת בהקלטות vivo של פעילות עצבית בדג זברה מבוגר. שיטות הקלטה תאית משמשות, מתן מדידות מתח של פעילות חשמלית בתוך אזור קטן של רקמה עצבית. שיטה זו של חקירה כרוכה במעקב אחר מספר גדול של תאים בבעלי חיים מתנהגים 1. בעבר, הקלטות פרוסה כבר בוצעו בשני מבוגרים וזחלים, כמו שיש לי הכנות כוס העין והקלטות electroretinogram. ניסויים אלה במידה רבה כבר בוצעו לפרטים תגובות פיסיולוגיות של מערכות חושיות שונות 2-5. עד לאחרונה, הכנות מוח שלמות היו זמינות לביצוע אלקטרופיזיולוגיה עם 3,6,7 זחל דג הזברה, בהם פיזור נשימה וחמצן יכול להתרחש דרך העור בלבד. ההכנה שלנו מאפשרת פעילות נוירולוגית יליד דג הזברה מבוגר כדי להימדד בעוד החיה נשארה בהכרה מלאה ומודעת oו סביבתו.
דג הזברה (Danio rerio) לשחק כרגע תפקיד בסיסי כמודל למחקרים גנטיים, טוקסיקולוגי, תרופתיים, וphysiopathological 3. דג הזברה זכה לנראות בתחום של מדעי המוח, כי הם חולקים הומולוגיה נרחבת עם יונקים ברמות גנטיות, העצבית והמערכת האנדוקרינית 8. במהלך העשור האחרון, טכניקות neuroanatomic וimmunohistochemical סטנדרטיות היו בשימוש כדי לקבוע את הארגון האופייני מפורט של מערכת עצבים דג הזברה 9-12 ושל ההפצה של נוירוטרנסמיטרים שונים 3,8,13. לאחרונה, חוקרים העבירו את המיקוד שלהם ללימודים תפקודיים 14,15, שרבים מהם במרכז על תהליכים התנהגותיים 16-19 ומאפיינים של מערכות אלקטרו חושיות 2,13,20. מספר קטן של מחקרים אלה התמקדו בפעילות החשמלית של אזורים הספציפיים של adult מוח דג הזברה 21-23, אך לא בוצעו באמצעות vivo בגישה.
פרוטוקול זה יכול להיות מותאם ללימודי אלקטרו של שתי פעילות הספונטנית ועוררה בתוך מערכת עצבים דג הזברה כדי לתאר את דפוסי פעילות באזורי מוח מסוימים. השימוש בטכניקה זו מאפשר השוואות שיש להבחין בין פעילות הנוירולוגית של שלבי זחל צעירים ומבוגרים. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו מאפשר השוואה בין שינויים גנטיים או תרופתיים. יחד עם גישות אחרות, כגון הנדסה גנטית או בדיקות פרמקולוגיות, שיטה זו מציעה אפשרות חדשה לניתוח הפונקציונלי של תקשורת העצבית ופלסטיות בבעלי החיים הבוגרים בשלמותה, כמו גם ליישומים אפשריים, כגון לומד אפילפסיה התחלה מאוחרת או תהליכי ניוון עצבי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי למדוד את הפעילות העצבית של דג הזברה מבוגר in vivo. בעזרת תרגול, פעילות עצבית יכולה להיות שנצפתה באופן עקבי, אם כי המאפיינים (אמפליטודה וצורה של אירועים) של הפעילות שנרשמה יכולים להשתנות בין דגים בודדים. ניצול של טכניקת ההקלטה תאית יכול להס?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NINDS גרנט R01NS070159 (לTMD, הליגה להגנה יהודית וATS).
Materials
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
Referenzen
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neurowissenschaften. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. . Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P., Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. . Fish Physiology: Zebrafish. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J. Neurosci. 27, 4984-4994 (2007).
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
