エキソソームの定量化とサイズの測定のための革新的方法

注：この作品で提示実験は、デュッセルドルフ大学の制度的倫理委員会によって承認されている。 1.エキソソーム準備静脈穿刺（9ミリリットルの合計）を介して3クエン酸チューブに全血を収集します。 15ミリリットルファルコンチューブに血液を注ぐ。 血漿からの細胞の分離を開始するために、4℃で20分間、1500×gで試料を集める。新しい15ミリリットルファルコンチューブに上清を移し。 遠心プラズマからすべての細胞を除去するために4℃で20分間、2800×gで試料（細胞を含まない血漿; CFP）。超遠心分離チューブ、チューブあたり1mlにCFPを転送します。 エキソソームを枯渇させる、4℃で90分間100,000×gで遠心し。上清900μlのを削除します。超遠心分離管中の残りの100μlのペレットを再懸濁。 900μlのPBSを追加します。 4℃で30分間100,000×gで再び遠心し。 SU900μlのを削除pernatant。残りの100μlでペレットを再懸濁。 転送蒸留水40ml中に再懸濁5〜20μlの。より大きな粒子からエキソソームを分離するために450nmのフィルターを介してサスペンションをフィルタリングします。粒子測定のために、この最終懸濁液を使用してください。 粒子追跡インストゥルメントの2の起動手続きソフトウェア·アイコンをダブルクリックしてプログラムを起動します。プロトコルを通じてそれらを切り替えるために、様々なソフトウェアのタブ（「セルチェック」、「測定」、「分析」）をクリックします。 起動手順の自動化実施のための画面上の指示に従ってください。セル品質チェックとオートアライメントの両方のボックスを選択します。 注：必要に応じてこれらの手順のいずれもが「セルチェック」タブ上のボタン（A）または（B）を押すことにより、別々に繰り返すことができる。 NTA器の入口と出口ポートを開いて、10メートルを注入lは、入口ポートを介してセルチャネルシリンジによって水を蒸留した。水の最後の量が注入されているように、出口ポートを閉じます。廃液を収集するために、出口ポートの下にビーカーを置きます。測定セルは、気泡がないことを確認して、システム内に気泡を注射器はありません。すぐに入口ポートを閉じます。 「OK」をクリックすることで、細胞の品質チェックを実行します。ソフトウェアは、数秒後に細胞質の高い結果を表示します。 すべての粒子はまだソフトウェアのライブビュー画面内または品質チェックの結果だけ良いか悪い場合を可視化している場合は、残りの粒子が測定セルから削除されるまで、ステップ2.3を繰り返します。また、粒子の蓄積を避けるために、各測定後に、ステップ2.3を繰り返します。蒸留水の注入を繰り返し、セルチェックすると「良い」結果を生成しない場合は、2.9に進みます。 均一な200 nmの大きさのPOLを含む制御サスペンションを準備ystyrene粒子は、レーザー顕微鏡の焦点を合わせるために使用する。 600±100粒子は、ライブビュー画面ごとに表示されるように必要な濃度を得るために、蒸留水500mlに、機器の製造元から提供さ懸濁液濃縮物の一滴を加える。 ステップ2.3で説明したようにNTAの機器に整列サスペンションを注入。を押して "OK"オートアライメント、システムが自動的に2焦点の最適な位置を見つけるでしょうそれを通して、自動化ルーチンを開始します。 プロンプトがシステムを記載した表示されたら、測定を開始するために[OK]をクリックして、今の実験の準備ができている。 時折、エタノールの30％溶液で細胞を洗浄することにより、実験間で手動でセルチャネルをきれい。ソフトウェアは自動エラーレポートが表示されたときにチャンネルを清掃してください。 サンプルの3.測定 EAの前に蒸留水でチャンネルをフラッシュしますchのサンプル測定（​​ステップ2.3で説明したように）。 ステップ2.3で説明したように、チャネルにログイン（セクション1で調製）エキソソームサスペンションを注入。 必要に応じてソフトウェアで、次の主なパラメータを調整します。 感度。最適な感度範囲を見つけるために、異なる感度レベル用の画面ごとに測定した粒子の曲線を表示するには、ボタン「感度対粒子の数」をクリックしてください。曲線の最大傾斜の前に感度レベルを選択しました。高感度レベルは、より小さな粒子の可視化を可能にするだけでなく、バ​​ックグラウンドノイズに関連する問題が増加します。 最小輝度。フィルタとして、この機能を使用するには、エキソソームの測定のために20の開始明るさを選択しました。ブランクに強く光散乱粒子まで、このパラメータを調節する。アーティファクトを散乱弱く増幅するためにそれを調節する。実験を通して、必要に応じて明るさを変更します。 注：軽粒子スキャッタあまりに強く重なって誤って分析から除外することができる。 最小と最大のサイズ。最小および最大の大きさを調整することによって、オーバーサイズの粒子からピクセルノイズや不要な散乱を排除するためにデジタルフィルタを設定する。エキソソームの測定のために10〜500画素の範囲を使用してください。 シャッター。カメラは1/300秒に開いている期間を調整します。 ライブのパラメータを読み出す。 「ライブ映像」ボタンをクリックして任意の時点で、デジタルとアナログビュー手口を切り替えます。 実験を通して、カラーコード化された指標として、試料の飽和状態が表示され散乱強度バーを、監視する。散乱バーが赤の場合エキソソームを分析しないでください。このような場合には、さらに、この現象を回避するために、サンプルを希釈。実験条件は、試料懸濁液の操作を禁止する場合は、感度をダウンレギュレートまたはソフトウェアの明るさをアップレギュレートする測定結果を改善するettings。 注：パーティクルの極めて高濃度のサンプルが分析されている場合、散乱は、個々の粒子を融合し、それらが1つの粒子としてカウントされます。 ディスプレイからの視野でカウント粒子の数に注意してください。 「測定」タブをクリックします。 「実行オプション」配列内の設定を選択します。 各買収する前に、繰り返しチェック粒子ドリフトテストのための「チェック運動」を選択します。全体の分析を開始する前に、少なくとも1回テストを実行します。ドリフトが20μm/秒よりも高い場合、サンプルが流れて停止するように、測定を継続する前に待機。 実験数（5）と、それらの間の時間遅延（0）を選択する。 必要に応じて、「サンプルのチェック」を実行します。このテストでは、起動手順におけるオートアライメントの一部であり、必要に応じてその後に繰り返すことができる。 </LI> 最後に「実行映像取得」ボタンをクリックします。新しいウィンドウに、サイクル数（15）と測定位置（11）の数を定義する。 注：レーザヘッドと顕微鏡11の異なる位置に粒子数を分析するために移動させることができる。実験的な需要に応じて、実験は1つの位置に、または異なる位置で実行する必要があるかどうかを決定する。 粒子がビデオ解像度（低）を設定することにより、1個々の粒子としてカウントされるために追跡する必要がある最小限の時間の長さを確認してください。短い追跡期間中に低い解像度をもたらす。 ファイル名を選択し、測定を開始するために「OK」をクリックしてください。 結果の解釈4。 「結果」タブに測定した後に表示された以下の結果とパラメータを表示しますトレースされた粒子の（1）総数、一部の（2）平均数位置、および（3）粒子濃度あたりicles。 数値の粒子数の割合に粒径（直径、面積および容積）の比、ならびに平均および標準分化の値に対する結果の平均表を見る。 複数のピークがグラフ解析に存在する場合、ピーク分析表を使用してください。このテーブルには、第一または第二のそれぞれのピークよりも小さい粒子の分布を示している。 サイズによって粒子の分布を見るために測定し算出グラフを表示します。設定を変更するには、表示モードで、グラフ上のアイコンを使用してください。